根際促生菌D5A菌株發酵條件優化

陳翠++陳丹丹++馮清++陳祁怡+吳向華

摘要：考察不同碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、時間等參數對根際促生菌D5A菌株發酵的影響。結果表明，在裝液量為30 mL/250 mL的三角瓶中，按5%接種量將D5A菌株接種到以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源、碳氮比為2 ∶ 1、生長因子為酵母粉、pH值為6的培養基中，150 r/min、37 ℃培養48 h，可發酵產生最大生物量。

關鍵詞：根際促生菌；發酵；優化

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0516-03

收稿日期：2015-04-29

基金項目：江蘇省大學生創新項目（編號：201311460046X）；江蘇省“生態學”重點一級建設學科項目。

作者簡介：陳翠（1992—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事生物學研究。E-mail：1448405968@qq.com。

通信作者：吳向華，博士，副教授，主要從事微生物學教學與研究工作。E-mail：xhw610@163.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長及對礦質營養的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1]。PGPR具有固氮、解磷、釋鉀、產生植物激素和分泌抗生素等能力，或具有其中之一的能力[2-3]。PGPR對植物生長具有直接或間接促進作用。PGPR的直接促進作用是指某些植物根際促生菌可合成對植物生長發育有直接作用的物質（如生長素等） 以及改變土壤中某些無效元素的形態，使之有效化而利于植物吸收（如固氮、解磷等）[4-5] 。對植物生長的間接作用是指某些植物根際促生菌抑制或減輕某些植物病害對植物生長發育和產量的不良影響[6-7]。接種PGPR普遍被認為是一種環境友好、經濟有效的提高作物產量和品質的方法，應用前景廣闊。本研究選擇碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、時間等參數，探索優化根際促生菌D5A菌株的發酵條件，旨在為工業化生產根際促生菌D5A菌株提供理論依據。

1材料與方法

1.1菌株

根際促生菌D5A菌株克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[8]由中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室惠贈。

1.2培養基

牛肉膏蛋白胨培養基[9]。

1.3方法

1.3.1碳源對D5A菌株生長的影響[10-11]以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，分別以3%糖蜜、3%可溶性淀粉、3%葡萄糖、3%蔗糖、3%玉米糝為碳源，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.2氮源對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，以篩選出的最適碳源為碳源，分別以1.5%牛肉膏、1.5%硫酸銨、1.5%草酸銨、1.5%蛋白胨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸鐵銨、1.5%酵母膏為氮源，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.3碳氮比對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，以篩選出的最佳碳源、氮源為碳氮源，分別用1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1碳氮比，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.4生長因子對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，以篩選出的最佳碳氮比為碳氮比，分別用2 020 μg/L維生素B、2 020 μg/L酵母粉、2 020 μg/L葉酸為生長因子，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.5pH值對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳碳氮比、生長因子配制培養基，分別調節pH值至5、6、7、8、9，按2%接種量于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.6溫度對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按2%接種量分別于28、37、42 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.7裝液量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按2%接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30、50、80、100、150 mL的250 mL培養基中發酵培養，于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.8轉速對D5A菌株生長的影響以篩選出的最適裝液量、最適培養基配方配制培養基，按2%接種量接入D5A菌株，分別在100、150、180 r/min下于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.9接種量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，分別按1%、2%、5%、10%、20%的接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養基中發酵培養，于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.10培養時間對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按5%接種量將D5A菌株接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養基中發酵培養，分別于37 ℃ 培養12、24、36、48、60、72 h，測定發酵液生物量。

1.3.11生物量的測定按照稀釋平板計數法[12]測定活菌總數。

1.3.12數據統計采用SPSS 16.0軟件分析數據。

2結果與分析

2.1最適碳源選擇

由圖1可知，葡萄糖作為碳源能獲得最大生物量，其次是糖蜜、蔗糖、玉米糝，D5A菌株在可溶性淀粉中生長狀況最差。究其原因，可能是由于葡萄糖、蔗糖都屬于速效性碳源，適合菌體大量生成，玉米糝、淀粉都屬于緩釋型碳源，需要分解為單糖后菌體才能大量生長。因此，選擇葡萄糖作為最適碳源。

2.2最適氮源選擇

由圖2可知，D5A菌株在牛肉膏中生長最好，但與硫酸鐵銨差異不顯著，但顯著高于硫酸銨、蛋白胨、氯化銨。牛肉膏不僅可以作為氮源，而且在碳源不足時可補充碳源，也可提供微量元素，故選擇牛肉膏為最適氮源。

2.3最適碳氮比選擇

以葡萄糖、牛肉膏作為碳氮源，分別按1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1比例配制培養基，按2%接種量于 37 ℃ 連續培養48 h，測定生物量。由圖3可以看出，碳氮比為 2 ∶ 1 時D5A菌株生長狀況最好，其次為1 ∶ 1，1 ∶ 3、5 ∶ 1比較差，且2 ∶ 1、1 ∶ 1組處理下菌株生物量與其他幾組之間存在顯著差異，故選用2 ∶ 1為最佳碳氮比。

2.4最適生長因子選擇

以維生素B、酵母粉、葉酸為生長因子，按2%接種量于

37 ℃ 連續培養48 h，由圖4可以看出，不同生長因子下根際促生菌的發酵情況由好到差依次為：酵母粉>葉酸>維生素B，且酵母粉與其2兩組之間無顯著差異，選用酵母粉為最佳生長因子。

2.5最適pH值選擇

由圖5可知，D5A菌株在pH 值為6時生長最好，其次是pH值為9、5，在pH值為7、8時D5A菌株生長較差。pH值為6處理下菌落數與pH值為7、8存在顯著差異，因此選擇pH值為6為最佳pH值。

2.6最適溫度的選擇

由圖6可知，37 ℃時菌株生長情況最好，其次是42、28 ℃，但各溫度處理之間無明顯差異。菌株一般在37 ℃時生長較好，本試驗也說明了這點，溫度過高或過低對酶都有一定影響，有可能導致酶失活，故選用37 ℃為最佳發酵溫度。

2.7最適裝液量的選擇

由圖7可知，D5A菌株在30 mL/250 mL裝液量處理下生長最好，其次是50 mL/250 mL、100 mL/250 mL，較差的是80 mL/250 mL、150 mL/250 mL，因此裝液量選擇 30 mL/250 mL 最佳。

2.8轉速對D5A菌株生長的影響

由圖8可知，150 r/min 轉速處理下D5A菌株生長狀態最佳，150、180 r/min處理下菌落數差異性較小，但150 r/min與100 r/min之間存在顯著差異，故轉速選擇150 r/min對D5A菌株進行培養。

2.9接種量對D5A菌株生長的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，菌株的生長情況變好，但是當接種量增長到20%時菌落數明顯減少。5%、10%接種量處理下菌株生長較佳，且兩者之間無顯著差異，10%接種量與20%接種量之間差異顯著。考慮到經濟因素，選擇5%接種量更為合適。

2.10培養時間對D5A菌株的影響

由圖10可知，隨著培養時間的增加，菌株的生長狀態逐漸變好，但當培養時間增加為72 h時，菌落數有所下降。培養時間為48、60 h時菌株的生長狀態最好，且兩者之間無顯著差異。培養時間為12 h時菌株生長情況最差。綜合考慮，選擇48 h培養時間最為合適。

3結論

本試驗設置碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、發酵時間等單因子試驗，獲得根際促生菌的最適發酵條件是在牛肉膏蛋白胨培養基中，以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源，碳氮比為2 ∶ 1，生長因子為酵母粉，在37 ℃、pH值為6、裝液量30 mL/250 mL、5%接種量、150 r/min 條件下培養48 h，根際促生菌產量最高。

參考文獻：

[1]李引. 紅壤中花生根際促生菌的篩選鑒定及其應用[D]. 南京：南京農業大學，2012.

[2] Karakurt H，Kotan R. Effects of plant growth promoting rhizobacteria on fruit set，pomological and chemical characteristics，color values，and vegetative growth of sour cherry （Prunus cerasus cv.Kütahya） [J]. Turkish Journal of Biology，2011，35（3）：283-291.

[3] Weyens N，van der Lelie D，Taghavi S. Exploiting plant-microbe partnerships to improve biomass production and remediation[J]. Trends Biotechnol，2009，27（10）：591-598. .

[4]沈崇靈. 法理學 [M]. 北京：北京大學出版社，2014.

[5]康貽軍，程潔，梅麗娟，等. 植物根際促生菌作用機制研究進展[J]. 應用生態學報，2010，21（1）：232-238.

[6]黃曉東，季尚寧，Bernard Glick，等. 植物促生菌及其促生機理[J]. 現代化農業，2002（6）：7-15.

[7]梁建根，施躍峰，竺利紅. 植物根圍促生細菌作用機制的研究[J]. 現代農業科技，2008（17）：133-135.

[8]張國壯. 產ACC脫氧酶根際促生菌的分離鑒定及其接種對小麥乙烯代謝和生長的效應[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2014.

[9]沈萍，陳向東. 微生物學實驗[M]. 4版. 北京：高等教育出版社，2013.

[10]馬海林，邢尚軍，劉方春，等. 櫻桃根際促生細菌YT3的培養基及發酵條件優化 [J]. 東北林業大學學報，2013，41（5）：126-129.

[11]洪鵬，安國棟，胡英美，等. 解淀粉芽孢桿菌HF-01發酵條件優化[J]. 中國生物防治學報，2013，29（4）：569-578.

[12]周德慶，徐德強. 微生物學實驗教程[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2010.

陳翠 陳丹丹 馮清 陳祁怡 吳向華

摘要：考察不同碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、時間等參數對根際促生菌D5A菌株發酵的影響。結果表明，在裝液量為30 mL/250 mL的三角瓶中，按5%接種量將D5A菌株接種到以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源、碳氮比為2 ∶ 1、生長因子為酵母粉、pH值為6的培養基中，150 r/min、37 ℃培養48 h，可發酵產生最大生物量。

關鍵詞：根際促生菌；發酵；優化

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0516-03

收稿日期：2015-04-29

基金項目：江蘇省大學生創新項目（編號：201311460046X）；江蘇省“生態學”重點一級建設學科項目。

作者簡介：陳翠（1992—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事生物學研究。E-mail：1448405968@qq.com。

通信作者：吳向華，博士，副教授，主要從事微生物學教學與研究工作。E-mail：xhw610@163.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長及對礦質營養的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1]。PGPR具有固氮、解磷、釋鉀、產生植物激素和分泌抗生素等能力，或具有其中之一的能力[2-3]。PGPR對植物生長具有直接或間接促進作用。PGPR的直接促進作用是指某些植物根際促生菌可合成對植物生長發育有直接作用的物質（如生長素等） 以及改變土壤中某些無效元素的形態，使之有效化而利于植物吸收（如固氮、解磷等）[4-5] 。對植物生長的間接作用是指某些植物根際促生菌抑制或減輕某些植物病害對植物生長發育和產量的不良影響[6-7]。接種PGPR普遍被認為是一種環境友好、經濟有效的提高作物產量和品質的方法，應用前景廣闊。本研究選擇碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、時間等參數，探索優化根際促生菌D5A菌株的發酵條件，旨在為工業化生產根際促生菌D5A菌株提供理論依據。

1材料與方法

1.1菌株

根際促生菌D5A菌株克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[8]由中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室惠贈。

1.2培養基

牛肉膏蛋白胨培養基[9]。

1.3方法

1.3.1碳源對D5A菌株生長的影響[10-11]以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，分別以3%糖蜜、3%可溶性淀粉、3%葡萄糖、3%蔗糖、3%玉米糝為碳源，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.2氮源對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，以篩選出的最適碳源為碳源，分別以1.5%牛肉膏、1.5%硫酸銨、1.5%草酸銨、1.5%蛋白胨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸鐵銨、1.5%酵母膏為氮源，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.3碳氮比對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，以篩選出的最佳碳源、氮源為碳氮源，分別用1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1碳氮比，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.4生長因子對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，以篩選出的最佳碳氮比為碳氮比，分別用2 020 μg/L維生素B、2 020 μg/L酵母粉、2 020 μg/L葉酸為生長因子，按2%接種量于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.5pH值對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳碳氮比、生長因子配制培養基，分別調節pH值至5、6、7、8、9，按2%接種量于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.6溫度對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按2%接種量分別于28、37、42 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.7裝液量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按2%接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30、50、80、100、150 mL的250 mL培養基中發酵培養，于37 ℃ 連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.8轉速對D5A菌株生長的影響以篩選出的最適裝液量、最適培養基配方配制培養基，按2%接種量接入D5A菌株，分別在100、150、180 r/min下于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.9接種量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，分別按1%、2%、5%、10%、20%的接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養基中發酵培養，于37 ℃連續培養48 h，測定發酵液生物量。

1.3.10培養時間對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養基配方配制培養基，按5%接種量將D5A菌株接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養基中發酵培養，分別于37 ℃ 培養12、24、36、48、60、72 h，測定發酵液生物量。

1.3.11生物量的測定按照稀釋平板計數法[12]測定活菌總數。

1.3.12數據統計采用SPSS 16.0軟件分析數據。

2結果與分析

2.1最適碳源選擇

由圖1可知，葡萄糖作為碳源能獲得最大生物量，其次是糖蜜、蔗糖、玉米糝，D5A菌株在可溶性淀粉中生長狀況最差。究其原因，可能是由于葡萄糖、蔗糖都屬于速效性碳源，適合菌體大量生成，玉米糝、淀粉都屬于緩釋型碳源，需要分解為單糖后菌體才能大量生長。因此，選擇葡萄糖作為最適碳源。

2.2最適氮源選擇

由圖2可知，D5A菌株在牛肉膏中生長最好，但與硫酸鐵銨差異不顯著，但顯著高于硫酸銨、蛋白胨、氯化銨。牛肉膏不僅可以作為氮源，而且在碳源不足時可補充碳源，也可提供微量元素，故選擇牛肉膏為最適氮源。

2.3最適碳氮比選擇

以葡萄糖、牛肉膏作為碳氮源，分別按1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1比例配制培養基，按2%接種量于 37 ℃ 連續培養48 h，測定生物量。由圖3可以看出，碳氮比為 2 ∶ 1 時D5A菌株生長狀況最好，其次為1 ∶ 1，1 ∶ 3、5 ∶ 1比較差，且2 ∶ 1、1 ∶ 1組處理下菌株生物量與其他幾組之間存在顯著差異，故選用2 ∶ 1為最佳碳氮比。

2.4最適生長因子選擇

以維生素B、酵母粉、葉酸為生長因子，按2%接種量于

37 ℃ 連續培養48 h，由圖4可以看出，不同生長因子下根際促生菌的發酵情況由好到差依次為：酵母粉>葉酸>維生素B，且酵母粉與其2兩組之間無顯著差異，選用酵母粉為最佳生長因子。

2.5最適pH值選擇

由圖5可知，D5A菌株在pH 值為6時生長最好，其次是pH值為9、5，在pH值為7、8時D5A菌株生長較差。pH值為6處理下菌落數與pH值為7、8存在顯著差異，因此選擇pH值為6為最佳pH值。

2.6最適溫度的選擇

由圖6可知，37 ℃時菌株生長情況最好，其次是42、28 ℃，但各溫度處理之間無明顯差異。菌株一般在37 ℃時生長較好，本試驗也說明了這點，溫度過高或過低對酶都有一定影響，有可能導致酶失活，故選用37 ℃為最佳發酵溫度。

2.7最適裝液量的選擇

由圖7可知，D5A菌株在30 mL/250 mL裝液量處理下生長最好，其次是50 mL/250 mL、100 mL/250 mL，較差的是80 mL/250 mL、150 mL/250 mL，因此裝液量選擇 30 mL/250 mL 最佳。

2.8轉速對D5A菌株生長的影響

由圖8可知，150 r/min 轉速處理下D5A菌株生長狀態最佳，150、180 r/min處理下菌落數差異性較小，但150 r/min與100 r/min之間存在顯著差異，故轉速選擇150 r/min對D5A菌株進行培養。

2.9接種量對D5A菌株生長的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，菌株的生長情況變好，但是當接種量增長到20%時菌落數明顯減少。5%、10%接種量處理下菌株生長較佳，且兩者之間無顯著差異，10%接種量與20%接種量之間差異顯著。考慮到經濟因素，選擇5%接種量更為合適。

2.10培養時間對D5A菌株的影響

由圖10可知，隨著培養時間的增加，菌株的生長狀態逐漸變好，但當培養時間增加為72 h時，菌落數有所下降。培養時間為48、60 h時菌株的生長狀態最好，且兩者之間無顯著差異。培養時間為12 h時菌株生長情況最差。綜合考慮，選擇48 h培養時間最為合適。

3結論

本試驗設置碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉速、接種量、發酵時間等單因子試驗，獲得根際促生菌的最適發酵條件是在牛肉膏蛋白胨培養基中，以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源，碳氮比為2 ∶ 1，生長因子為酵母粉，在37 ℃、pH值為6、裝液量30 mL/250 mL、5%接種量、150 r/min 條件下培養48 h，根際促生菌產量最高。

參考文獻：

[1]李引. 紅壤中花生根際促生菌的篩選鑒定及其應用[D]. 南京：南京農業大學，2012.

[2] Karakurt H，Kotan R. Effects of plant growth promoting rhizobacteria on fruit set，pomological and chemical characteristics，color values，and vegetative growth of sour cherry （Prunus cerasus cv.Kütahya） [J]. Turkish Journal of Biology，2011，35（3）：283-291.

[3] Weyens N，van der Lelie D，Taghavi S. Exploiting plant-microbe partnerships to improve biomass production and remediation[J]. Trends Biotechnol，2009，27（10）：591-598. .

[4]沈崇靈. 法理學 [M]. 北京：北京大學出版社，2014.

[5]康貽軍，程潔，梅麗娟，等. 植物根際促生菌作用機制研究進展[J]. 應用生態學報，2010，21（1）：232-238.

[6]黃曉東，季尚寧，Bernard Glick，等. 植物促生菌及其促生機理[J]. 現代化農業，2002（6）：7-15.

[7]梁建根，施躍峰，竺利紅. 植物根圍促生細菌作用機制的研究[J]. 現代農業科技，2008（17）：133-135.

[8]張國壯. 產ACC脫氧酶根際促生菌的分離鑒定及其接種對小麥乙烯代謝和生長的效應[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2014.

[9]沈萍，陳向東. 微生物學實驗[M]. 4版. 北京：高等教育出版社，2013.

[10]馬海林，邢尚軍，劉方春，等. 櫻桃根際促生細菌YT3的培養基及發酵條件優化 [J]. 東北林業大學學報，2013，41（5）：126-129.

[11]洪鵬，安國棟，胡英美，等. 解淀粉芽孢桿菌HF-01發酵條件優化[J]. 中國生物防治學報，2013，29（4）：569-578.

[12]周德慶，徐德強. 微生物學實驗教程[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2010.