糖尿病對直結腸癌小鼠生存的影響

劉虹，龔志軍，卿篤桔，李恩就，黎飛江門市中心醫院胃腸外科，廣東江門　529000

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糖尿病對直結腸癌小鼠生存的影響

劉虹，龔志軍，卿篤桔，李恩就，黎飛
江門市中心醫院胃腸外科，廣東江門529000

［摘要］目的探討糖尿病對直結腸癌小鼠生存及預后的影響。 方法BALB/c小鼠60只，觀察時間2013年3月—2013 年4月，共4周，小鼠飼養于中山大學北校區實驗動物中心，隨機分為3組，每組20只，分別為A組：結直腸癌組，B組：糖尿病結直腸癌組，C組：對照組。B組小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。體外培養小鼠結腸癌細胞株CT26至對數生長期，制成單細胞懸液。并將此細胞懸液注入A、B組小鼠皮下，C組小鼠在皮下注入生理鹽水。觀察各組小鼠的生存時間、體重差、并發癥（腸梗阻、腸粘連、血性腹水等）的發生率及時間。建模成功4周后處死存活的小鼠，取靜脈血測定肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶以明確肝腎功能，解剖、大體觀察皮下腫瘤的生長和浸潤，病理學檢查是否有肝臟轉移及轉移瘤數量。結果處死前稱重，A、B組小鼠體質量分別為 （15.38±3.39）g和 （14.65± 2.59）g，與造模前相比明顯減輕（A：19.23±0.25 g，B：21.15±0.33 g），差異有統計學意義（P＜0.05），但A、B組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。3組小鼠的肝腎功能與造模前相比無明顯變化。A、B組注射部位皮下腫瘤體積比造模前明顯增大，差異有統計學意義（P＜0.05），且B組體積大于A組。結論糖尿病能促進結直腸癌腫瘤的生長和轉移，增加并發癥的發生率和嚴重程度，并可能提高死亡率。

［關鍵詞］糖尿病；結直腸癌；小鼠；并發癥；預后

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是結腸癌（colon cancer）和直腸癌（rectal cancer）的統稱，在我國的發病率逐年增加［1-2］。結直腸癌是發病率僅次于胃癌和食管癌的消化道腫瘤［3］，但到目前為止，對其病因和發病機制尚不明了。近年來的研究發現CRC的發病與糖尿病（diabetes mellitus，DM）關系密切［4］。DM患者中惡性腫瘤的發病率遠遠高于普通人群各年齡段的最高發病率，其中又以消化道腫瘤為多見，結直腸癌患者的5年生存率在50%～60%［5］。如何延長患者的生存時間、提高生存質量并改善預后是臨床面臨的主要問題。本實驗中我們建立DM及CRC小鼠，以了解DM對CRC患者生存和預后的影響。

1資料與方法

1.1材料與試劑

細胞與主要試劑：小鼠結腸癌細胞系CT26，DMEM培養液，吡格列酮（pioglitazone），二甲基亞砜（DMSO），四氧嘧啶，實驗動物與分組：6～8周齡的雌性BALB/c小鼠60只，體質量 16～20 g，隨機分為3組，每組20只，分別為A組：CRC組，B組：DM CRC組，C組：對照組。觀察時間2013年3月-2013年4月，共4周，小鼠飼養于中山大學北校區實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1 DM造模 B組小鼠采用腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。小鼠禁食12 h后，生理鹽水配置提及分數為10%的四氧嘧啶注射液，以250 mg/kg腹腔內注射。72 h后取尾靜脈血，2000 r/min離心5min，上層血清用葡萄糖氧化酶法測定小鼠血糖，若血糖值在11.1 mmol/L ～30.0 mmol/L之間為造模成功。

1.2.2 CRC造模 用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養小鼠結腸癌CT26細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中，0.25%的胰酶消化傳代，培養至對數生長期，制成濃度為1×106個/ml的單細胞懸液。將此細胞懸液直接注射入A、B組小鼠左側頸背部皮下，建立小鼠結腸癌CT26模型。8d后注射部位皮下出現小包塊，直徑2～3 mm，視為造模成功。C組小鼠采用相同的方法在左頸部皮下注入生理鹽水。

1.3觀察指標

1.3.1大體觀察 接種后觀察各組小鼠有無死亡、并發癥（腸梗阻、腹泄等）出現的例數和時間，并每周測量體質量。

1.3.2血清學監測 處死前取尾靜脈血，酶聯免疫分析法測量尿素氮、肌酐、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶以監測小鼠肝腎功能。

1.3.3病理學觀察造模成功4周后處死存活小鼠，剖腹觀察腫瘤的生長和浸潤情況，完整取出腫瘤后，用游標卡尺測量腫瘤的最長直徑 （a，cm）及其垂直徑（b，cm），計算腫瘤體積（V，cm3），V=1/2×ab2。再與肝臟組織一起，經4%多聚甲醛溶液固定24 h后，乙醇梯度脫水、二甲苯透明，常規石蠟包埋，5 um厚連續切片。60℃烤箱中放置4 h后于37℃過夜。脫蠟后蒸餾水沖洗3遍，蘇木精-伊紅染色，觀察局部腫瘤的生長和浸潤以及有無肝轉移。

1.4統計學分析

采用SPSS 11.0統計軟件對數據進行處理，計數資料用（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1一般情況

觀察期內3組小鼠均無死亡，但A、B組小鼠的活動明顯減少和遲緩，進食和精神狀態差，C組小鼠活動正常。A、B組小鼠皮下包塊逐漸增大，于第三周時出現排便減少，有時有稀便。處死后稱重，A、B組小鼠體質量分別為（15.38±3.39）g和（14.65±2.59）g，與造模前相比明顯減輕A：（19.23±0.25）g、B：（21.15±0.33）g，差異有統計學意義（P＜0.05），但A、B組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1　造模前后3組小鼠的體質量變化表（±s）

表1　造模前后3組小鼠的體質量變化表（±s）

注：與造模前相比*P＜0.05。

組別（n=20）　造模前　　造模后A B C 19.23±0.25 21.15±0.33 20.77±0.31 15.38±3.39* 14.65±2.59* 21.24±0.46

2.2血清學監測

3組小鼠的肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶與造模前接近，差異無統計學意義（P＞0.05），組間差異亦無統計學意義（P＞0.05）。

2.3病理學觀察

C組小鼠注射局部和肝臟均未發現有腫瘤生長和浸潤。A、B組小鼠皮下注射部位均可見明顯的腫塊，邊緣不清楚，與周圍組織連結緊密，呈浸潤性生長，其中A組腫瘤體積為 （2.518±0.102）cm3，B組腫瘤體積為 （3.478± 0.159）cm3，均與造模成功時V=（0.013±0.026）cm3有明顯增大（P＜0.05），且兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。同時，A組小鼠有14只在肝臟發現占位病變，B組18只小鼠發現肝臟占位，均為多發，病理檢查均證實為小鼠結腸腺癌，兩組例數差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2　造模前后3組小鼠的腫瘤體積變化表（cm3，n=60）

3討論

近年來CRC的發病率逐漸增高，常規治療效果并不理想，05年其全球死亡人數位于第四位，僅次于肺癌、胃癌和肝癌［6-7］。最近的研究表明，DM患者發生CRC的風險比非DM患者增加了30%，另有研究認為與其他人相比，DM患者患CRC的風險高60%，且此患病率與DM病程的長短密切相關［8-9］。其原因有學者認為可能與兩種疾病有相同的致病因素（如高蛋白、高脂肪、高熱卡、低纖維素、少運動等）有關，也有人認為與DM患者體內存在胰島素抵抗引起的內源性高胰島素血癥、高血糖、氧化應激與炎癥以及性激素水平異常有關［10-11］。也有研究認為胰島素及其結構類似物IGF-Ⅰ可能對CRC的發生起促進作用，并增加患腫瘤的老年男性的死亡風險［12-13］。長期的高血糖和高胰島素狀態均不同程度的促進腫瘤生長，且胰島素直接進入肝臟，故DM患者也較容易發生肝癌和胰腺癌。本研究中動物的CRC采用人工方法造模而成，與DM的各種影響無關。DM人群患惡性腫瘤的風險較高，分期一般較晚，治療效果差，預后多不良。有分析認為，合并DM的腫瘤患者與無DM腫瘤患者相比，全因死亡率增高，DM組患者的思維風險是非DM組的3.58倍［14-15］。臨床研究發現，在未化療的結腸癌患者中，DM與非DM患者的結腸癌相關的死亡風險相似［16］。我們的前期研究也認為，DM對結腸癌復發轉移風險的影響僅限于接受過術后化療的患者［17］。這可能與疾病的病程、嚴重程度及基礎狀態有關。DM對患者一般情況、免疫水平、化療反應以及疾病恢復能力造成負面影響，從而引起CRC患者抗腫瘤治療的不足。本研究中，DM與非DM小鼠均來自體重相近的健康小鼠，腫瘤造模的時間一致，疾病的嚴重程度接近，且我們對造模過程中外界環境因素進行了比較嚴格的控制，各項操作均在無菌間進行，喂養時保證充足的光照以及相對平穩的溫度和濕度。排除了可能因素的干擾，更能說明DM本身對CRC病程和預后的影響。

CRC可有多個部位分布，近、遠、直腸在生理上及胚胎起源上均存在不同，發病機制不同，臨床表現也各異［17］。DM合并CRC時亦可能同時合并有其他疾病從而掩蓋了癥狀，臨床上患者常以非消化系統疾病的癥狀就診，就診時已有21.43%的患者有腫瘤轉移的征象［15］。近年來的研究提示的發生部位有由遠端向近端發展的趨勢，可能與DM患者常合并便秘有關［19］。本研究的結果顯示，DM組動物患結直腸癌后，各項癥狀比非DM組動物表現明顯，主要為體重減輕和消化系統功能紊亂，出現腸梗阻、腹瀉、腹水等并發癥，肝臟轉移也較非DM組（CRC組）早和迅速，轉移腫瘤體積大，數量多，但肝、腎功能尚在正常范圍，推測與觀察時間過短有關。同時，由于觀察期僅為4周，DM組和非DM組CRC小鼠均未死亡，故尚不能斷定DM對CRC死亡率有明顯影響。

胰島素是一種較弱的促生長因子，能夠促進細胞的有絲分裂從而加速細胞增殖、抵抗細胞凋亡。有學者認為降糖藥物可以通過對胰島素水平的調節從而影響腫瘤的發生，任何增加胰島素水平（內源性/外源性）的治療都有可能增加患腫瘤的風險［20］。我們認為目前此項理論尚無明確的證據支持，且腫瘤發生的風險與血糖的控制水平呈正相關。在下一步的研究中，我們將延長觀察時間，同時對動物血清細胞因子（如胰島素樣生長因子-Ⅰ、血管內皮生長因子-c等）進行監測，并輔以一定的藥物治療，以進一步探尋DM影響CRC預后的相關機制，為臨床預后判斷提供更為精準的信息。

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［中圖分類號］R735

［文獻標識碼］A

［文章編號］2096-1782（2016）02-0055-04

收稿日期：（2015-11-16）

［作者簡介］劉虹（1980-），女，湖南株洲人，本科，副主任醫師，主要從事胃腸道腫瘤治療，lhpetrel@163.com。

The Effects of Diabetes on Straight Colon Cancer Survival and Prognosis of Mice

LIU Hong，GONG Zhijun，QING Duju，LI Enjiu，LIFei
Department of gastrointestinal surgery，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen，Guangdong 529000

［Abstract］Objective To explore the effects of diabetes on straight colon cancer survival and prognosis of mice.Methods Sixty mice were randomly divided into 3 groups（each group was 20）.A:Colorectal Cancer Group；B:Diabetes，colorectal cancer group；C:control group.Mice in B group were abdominal injection of alloxan to set up hyperglycemia model.Colon cancer cell lines mice CT26 was cultured in vitro to logarithmic phase，prepared the single cell suspension，and subcutaneous injection to the mice of A and B group.Mice in C group were subcutaneous injection of saline.The survival time，weight and complications（intestinal obstruction，intestinal adhesion，bloody ascites，etc）were observed.Four weeks after the models were successful，mice were executed，and urea nitrogen，creatinine，alanine aminotransferase and aspertate aminotransferase of venous blood were tested to evaluate the function of liver and kidney.Anatomy and gross observation the growth and infiltration of the subcutaneous tumor，pathology check to explicit whether there were liver metastasis and number of metastases.Results All mice were weighed before death，the body mass was［（15.38±3.39）g］and［（14.65±2.59）g］. Compared with before the model［（19.23±0.25）g VS（21.15±0.33）g］，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there was no statistical significance between the 2 groups（P＞0.05）.The liver and kidney function of three groups of mice has no obvious change compared with before modeling.The subcutaneous tumor size at the injection site of A and B group was significantly larger than they did before modeling，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.And the volume of group B was greater than the group A.Conclusion Diabetes can promote tumor growth and metastasis of colorectal cancer，increases the incidence of complications and there severity，and may increase mortality.

［Key words］Diabetes；Colorectal cancer；Mice；Complication；Prognosis