中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化的研究思路與方法

慕永平+劉平

摘 要 肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過程，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)在該領(lǐng)域各有優(yōu)勢，如何發(fā)揮兩種醫(yī)學(xué)的思維優(yōu)勢，開展中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化研究是目前所面臨的關(guān)鍵科學(xué)問題，本文從病證結(jié)合、方證相應(yīng)，以及以效應(yīng)評價為基點，解析不同功效中醫(yī)古典方劑防治肝纖維化機(jī)制的新進(jìn)展，彰顯在中醫(yī)學(xué)思維指導(dǎo)下，充分應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，探究難治性疾病的治療方法，以期為中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化研究提供思路與方法。

關(guān)鍵詞 肝纖維化 中西醫(yī)結(jié)合 病證相關(guān) 方證相應(yīng)

中圖分類號：R259 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）13-0008-05

Therapeutic ideas and approaches in liver fibrosis guided by combination of traditional Chinese medicine and modern medicine*

MU Yongping1，2**， LIU Ping1，2***

（1. Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2. Institute of Liver Diseases， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Liver fibrosis， an early stage during the development of liver cirrhosis， is the common pathological process of various chronic hepatic diseases. Either modern medicine or traditional Chinese medicine （TCM） has its own advantage in anti-fibrotic therapy. In order to improve the therapeutic efficacy of anti-fibrotic therapy， researches should be recently focused on how to combine TCM and modern medicine and take advantages of each other. In this article， we review the new progresses made in classic TCM formulas with different efficacy for the prevention and treatment of liver fibrosis based on the methods of combination of disease and syndrome， evidence relevant and effect evaluation. This review also highlights the therapeutic methods of refractory diseases by taking full advantage of modern science and technique under the guidance of TCM thinking mode so as to provide prospect and methods for anti-fibrotic therapy by combination of TCM and modern medicine.

KEY WORDS liver fibrosis； combination of traditional Chinese medicine and modern medicine； correlation of disease

and syndrome； relationship between Chinese medical prescription and syndrome

肝纖維化主要是一個病理學(xué)概念，是指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分過度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或（和）功能異常的病理變化，結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化、匯管區(qū)與肝小葉內(nèi)纖維化；功能上可以表現(xiàn)為肝功能減退、門靜脈高壓等。肝纖維化的治療涉及祛除病因、調(diào)控免疫、抑制肝臟炎性損傷、肝細(xì)胞壞死或凋亡、阻抑ECM增生與沉積、促進(jìn)ECM降解、改善微循環(huán)及代謝障礙、減少并發(fā)癥等多種環(huán)節(jié)。近年來，慢性乙型肝炎與慢性丙型肝炎的抗病毒治療取得了重大進(jìn)展，尤其是丙肝病毒從體內(nèi)徹底清除已成為現(xiàn)實。但目前已有證據(jù)表明，有效抗病毒治療并不能替代針對肝纖維化的治療[1]，也不能降低肝癌的發(fā)生率[2-3]，至于新型清除丙肝病毒藥物的作用還有待于后續(xù)的長期隨訪觀察；迄今尚無抗肝纖維化生物或化學(xué)藥品上市。中醫(yī)藥在慢性肝病的治療中發(fā)揮重要作用，尤其在保肝、抗炎、抗肝纖維化以及免疫調(diào)節(jié)方面顯示出良好的綜合治療優(yōu)勢[4]。如何加強(qiáng)中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化的研究，抑制或減緩肝纖維化的進(jìn)程，阻止其發(fā)展為肝硬化、肝癌，仍是今后的重要研究任務(wù)。

1 中西醫(yī)病證結(jié)合抗肝纖維化的研究思路

肝纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理組織學(xué)概念，如何傳承中醫(yī)學(xué)理論，發(fā)掘傳統(tǒng)的診療優(yōu)勢，關(guān)鍵在于傳承源于中國文化的原創(chuàng)思維方法這一活的靈魂，堅持從現(xiàn)代臨床實踐中探索疾病的規(guī)律，結(jié)合中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)識，發(fā)展疾病的中醫(yī)病機(jī)理論，是中醫(yī)論治的主要依據(jù)；“病”和“證”是兩種醫(yī)學(xué)模式的核心內(nèi)容，體現(xiàn)不同思維方式認(rèn)識生命、健康與疾病的認(rèn)知形態(tài)，“病”與“證”結(jié)合實際上是兩種醫(yī)學(xué)思維方法的“交匯”，是將西醫(yī)疾病病理概念體系與中醫(yī)證的病機(jī)理論體系相結(jié)合研究疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。這既是以疾病為基礎(chǔ)、凸現(xiàn)不同患病人群的整體病理狀態(tài)的分類方式，也是運用中醫(yī)思維方法研究現(xiàn)代疾病的發(fā)展規(guī)律，以期從中醫(yī)的視角發(fā)現(xiàn)其病機(jī)特征以及相應(yīng)治療方法的新途徑；方劑是中醫(yī)學(xué)論治的主要手段，“證”及其與疾病和方劑的相關(guān)性，是“證”研究的重要科學(xué)問題；方證相應(yīng)的有效性及其療效機(jī)制是方劑研究的重要內(nèi)容。這是以提高臨床療效為目的，最大限度發(fā)揮兩種醫(yī)學(xué)體系在“病”、“證”治療上的各自優(yōu)勢，通過“病證結(jié)合、方證相應(yīng)”的效應(yīng)評價，不僅可能為機(jī)體宏觀病態(tài)表征與微觀病理生物學(xué)物質(zhì)變化之間建立聯(lián)系，也將成為探索現(xiàn)代難治性疾病的有效治療方法的可行途徑。這是堅持中醫(yī)學(xué)科特質(zhì)、適應(yīng)現(xiàn)代臨床實際需求的發(fā)展思路[5]。

近年來，針對肝炎后肝硬化的病證病機(jī)分析，立足于中醫(yī)學(xué)的思維特征，結(jié)合復(fù)雜系統(tǒng)的研究方法，即“從定性到定量的綜合集成法”，對900例肝炎后肝硬化患者的臨床信息進(jìn)行因子分析和兩階段聚類分析，結(jié)果顯示，肝炎后肝硬化癥狀和體征信息經(jīng)多元統(tǒng)計分析可劃分為兩大類，即疾病的共性病機(jī)（氣虛血瘀）和體現(xiàn)個體差異的5個常見證病機(jī)（肝腎陰虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、瘀熱結(jié)蘊(yùn)、脾腎陽虛、肝郁脾虛等）。在此基礎(chǔ)上，建立了證候判別的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)一步對355例患者進(jìn)行驗證，結(jié)果表明與臨床綜合辨證的主證候符合率達(dá)69.03%～78.95%。表明患病機(jī)體的自身感受（癥狀）及相關(guān)的外在表觀信息（體征）具有中醫(yī)證候理論臨床分類的客觀基礎(chǔ)[6-10]。

肝炎后肝硬化“氣虛血瘀”基本病機(jī)的發(fā)現(xiàn)，為臨床治療帶來變革，肝臟結(jié)締組織異常增生、組織結(jié)構(gòu)改變僅是肝硬化主要矛盾的一個方面，而肝實質(zhì)細(xì)胞的減少及功能減退則是肝硬化主要矛盾的另一方面，即氣虛血瘀、正虛邪實是肝硬化病理變化的一對主要矛盾。正氣虛損（肝實質(zhì)細(xì)胞減少及功能減退）可能是矛盾的主要方面，據(jù)此提出了“益氣化瘀”治法可能是針對肝硬化主要病理變化的基本治法，深入益氣化瘀方藥的研究與挖掘，可能為中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)肝硬化這一世界醫(yī)學(xué)難題作出貢獻(xiàn)[11]。因此，中醫(yī)病因病機(jī)具有“高概念”的醫(yī)學(xué)內(nèi)涵，以其為抓手，堅持自身的思維方法與研究模式，汲取現(xiàn)代科學(xué)設(shè)計思路與技術(shù)，將為未來整體醫(yī)學(xué)、健康醫(yī)學(xué)的發(fā)展作出新貢獻(xiàn)，對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床治療學(xué)的研究思路產(chǎn)生影響[12]。

2 方證相應(yīng)，闡明不同治法例方治療同一疾病取效的病理基礎(chǔ)

病的同一性及其同病中醫(yī)證病機(jī)或病理狀態(tài)的多樣性、動態(tài)性，是病證結(jié)合基礎(chǔ)研究的核心問題。從“病-方-效-證”相關(guān)角度可以認(rèn)為，不同功效方劑治療同一疾病取效的病理學(xué)基礎(chǔ)可能不同，既是解析病證病機(jī)科學(xué)內(nèi)涵的突破口，也是發(fā)掘古典方劑治療現(xiàn)代難治性病變的新途徑。既彰顯中醫(yī)學(xué)的思維特點，又充分汲取現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究思維的核心，乃是中西醫(yī)結(jié)合必須格守的基本原則。

基于氣虛血瘀為肝炎后肝硬化的中醫(yī)基本病機(jī)（病病機(jī)），肝腎陰虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)為主要證候病機(jī)的認(rèn)識，結(jié)合現(xiàn)代臨床實踐與中醫(yī)古籍相關(guān)記載，選擇有代表性、可資比較的古典方劑：益氣的黃芪湯、養(yǎng)陰的一貫煎、祛瘀的下瘀血湯及清熱祛濕的茵陳蒿湯，采用多種肝硬化模型進(jìn)行比較研究，基于干預(yù)效應(yīng)及主要作用機(jī)制，分析探討不同功效方劑干預(yù)（治療）肝硬化的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.1 清熱祛濕的茵陳蒿湯是干預(yù)DMN大鼠肝纖維化向肝硬化發(fā)展的有效方劑

在二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）造模2周后，從第3周開始給與不同方劑干預(yù)并繼續(xù)造模因素刺激至4周末，4個不同功效方劑中僅茵陳蒿療效顯著，模型大鼠肝硬化形成率為75%，茵陳蒿湯組為8.3%，其他3個方劑無顯著作用[13]。但在DMN造模4周并終止造模因素刺激后，給與不同方劑治療2周，結(jié)果除茵陳蒿湯具有顯著療效外，益氣的黃芪湯也呈現(xiàn)出顯著的治療效應(yīng)，可顯著改善肝組織病理變化，降低肝

組織膠原纖維含量[14]。

2.2 養(yǎng)陰的一貫煎與祛瘀的下瘀血湯是干預(yù)CCl4大鼠肝硬化的有效方劑

四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）造模12周制備大鼠肝硬化模型，第9周開始不同功效方劑干預(yù)，并繼續(xù)造模因素刺激至12周末。結(jié)果顯示模型對照組肝硬化的形成率為80%，用藥組分別為：一貫煎組11.1%、下瘀血湯組22.9%、黃芪湯組33.3%、茵陳蒿湯組40%。肝功能、肝組織病理改善及肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量的下降均以下瘀血湯和一貫煎為顯著，下瘀血湯降低Hyp含量最佳，一貫煎提高血清白蛋白（albumin，Alb）含量尤著[15-16]。

2.3 祛瘀的下瘀血湯是干預(yù)治療豬血清免疫性大鼠肝硬化的有效方劑

腹腔注射豬血清12周制備大鼠肝硬化模型；造模8周后、第9周開始分組經(jīng)口給與不同方劑并繼續(xù)造模至12周末。結(jié)果下瘀血湯可改善肝組織病理變化、顯著降低肝組織Hyp含量，其他方劑均無顯著作用[17]。

2.4 黃芪湯、茵陳蒿湯是干預(yù)治療大鼠膽汁淤積性肝硬化的有效方劑

膽總管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）制備膽汁性肝纖維化大鼠模型，造模1周后分組經(jīng)口給與不同功效方劑至5周末（給藥4周），結(jié)果表明，黃芪湯、茵陳蒿湯可顯著改善肝功能及肝組織病理變化，顯著降低肝組織Hyp含量，以黃芪湯的效應(yīng)為優(yōu)；其他方劑無明顯作用[18]。

以上研究結(jié)果提示不同造模方法制備同一疾病模型可能具備不同證的病態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)一步深入探索不同功效方劑的作用機(jī)制將有益于中西醫(yī)兩種醫(yī)學(xué)理論的溝通。

3 不同功效方劑抗肝纖維化的效應(yīng)機(jī)制

針對不同功效方劑有效抗肝纖維化、抑制肝硬化形成的相應(yīng)動物模型，深入解析其抗肝纖維化的效應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而反證與方劑相應(yīng)的中醫(yī)證的病理學(xué)基礎(chǔ)，可能將中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化研究推向兩種醫(yī)學(xué)理論高度融合的層次。

3.1 益氣黃芪湯的效應(yīng)機(jī)制

對于DMN大鼠肝纖維化，黃芪湯可顯著提高肝組織肝細(xì)胞生長因子α（hepatocyte growth factor α，HGFα）的表達(dá)、抑制轉(zhuǎn)化生長因子-b1（transforming growth factor-b1，TGF-b1）的表達(dá)以及Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制肝內(nèi)異常的細(xì)胞活化或轉(zhuǎn)分化（肝星狀細(xì)胞→肌成纖維樣細(xì)胞，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞→血管內(nèi)皮細(xì)胞）；即使在進(jìn)展期DMN大鼠肝纖維化，其抑制星狀細(xì)胞活化的效應(yīng)亦顯著優(yōu)于茵陳蒿湯[19-24]。而對于BDL大鼠肝纖維化模型，肝干細(xì)胞主要向新生的膽管上皮細(xì)胞分化，Notch信號通路參與這一過程[25]。在BDL 1周后予以黃芪湯及其有效組分黃芪總皂苷干預(yù)3周，發(fā)現(xiàn)兩者均可抑制肝干細(xì)胞向新生的膽管上皮細(xì)胞分化，抑制膽汁性肝纖維化的進(jìn)展，主要作用機(jī)制與抑制Notch信號通路活化有關(guān)[26]。

3.2 祛瘀下瘀血湯的效應(yīng)機(jī)制

祛瘀的下瘀血湯可顯著提高肝組織間質(zhì)型膠原酶降解活性、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）凋亡與ECM的降解、抑制肝竇毛細(xì)血管化及肝內(nèi)血管新生。對異種血清誘導(dǎo)的免疫性大鼠纖維化，下瘀血湯可調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metal protease，TIMP）之間的失衡狀態(tài)，提高組織金屬蛋白酶降解活性[27]；對于CCl4大鼠肝硬化，下瘀血湯可顯著降低其肝組織異常高表達(dá)的CD31、vWF、VEGF、VEGFR2、DAF、a-SMA及MMP-2、MMP-9活性，提高M(jìn)MP-13的表達(dá)水平，顯著抑制肝內(nèi)血管新生[28-29]；其提取部分可顯著促進(jìn)活化的HSCs凋亡，而對肝細(xì)胞增殖卻有一定的促進(jìn)作用，抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的去分化，改善肝竇毛細(xì)血管化病理改變[30]。

3.3 清熱利濕茵陳蒿湯的效應(yīng)機(jī)制

在DMN大鼠肝纖維化向肝硬化發(fā)展期，其肝內(nèi)CD68陽性的促炎庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）大量增加，茵陳蒿湯可抑制DMN肝硬化過程中促炎癥KCs的經(jīng)典激活；抑制BDL肝硬化大鼠增生膽管上皮細(xì)胞的血小板衍生生長因子-β（platelet-derived growth factor beta， PDGF-β）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的異常表達(dá)，以經(jīng)典激活庫普弗細(xì)胞為中心的肝組織炎癥病理變化是茵陳蒿湯產(chǎn)生效應(yīng)的方證病理學(xué)基礎(chǔ)[31-32]。對于已成模的DMN大鼠肝硬化，茵陳蒿湯可顯著提高肝組織CD68蛋白及MMP-9活性，抑制肝細(xì)胞的凋亡[22]。

3.4 養(yǎng)陰的一貫煎抗肝纖維化的效應(yīng)機(jī)制

基因芯片檢測結(jié)果提示，一貫煎可提高肝臟的生物轉(zhuǎn)化功能[33]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果提示該方能夠提高肝組織的抗氧化應(yīng)激功能[34]。并且發(fā)現(xiàn)該方可有效改善肝臟缺氧、保護(hù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞[35]，抑制骨髓細(xì)胞向星狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的分化[36]。

由于肝細(xì)胞占肝總體積的80%～90%，在各種慢性肝損傷過程中，肝細(xì)胞的增殖無疑受到抑制，盡管肝細(xì)胞移植后可通過多次分裂實現(xiàn)有效增殖，但也面臨供體肝細(xì)胞的數(shù)量過少、排異反應(yīng)、細(xì)胞活力低下、不能保持長時間體外增殖以及持續(xù)培養(yǎng)等實際問題[37]。因此，如何誘導(dǎo)肝臟干細(xì)胞向肝實質(zhì)細(xì)胞的正確分化顯得尤為重要。圍繞這一問題，近期我們還制備了2-乙酰氨基芴/CCl4（2-AAF/CCl4）肝纖維化模型（2-AAF的作用是在肝纖維化形成過程中，抑制肝實質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝干細(xì)胞增殖與分化），探討肝臟自體干細(xì)胞在肝纖維化形成過程中的分化取向及一貫煎對其影響。結(jié)果顯示在2-AAF/CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型，肝臟干細(xì)胞主要向肌成纖維細(xì)胞分化，發(fā)揮促纖維化作用，非經(jīng)典Wnt信號通路參與這一過程[38]。在2-AAF/CCl4造模的同時予以一貫煎干預(yù)，可顯著抑制非經(jīng)典Wnt信號通路的活化，進(jìn)而抑制肝干細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，發(fā)揮抗肝纖維化作用。然而將分離的原代胎肝干細(xì)胞移植到2-AAF/CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠，發(fā)現(xiàn)胎肝干細(xì)胞移植能夠顯著改善大鼠肝功能，抑制纖維化進(jìn)展，移植后的胎肝干細(xì)胞主要向肝實質(zhì)細(xì)胞分化，且與一貫煎聯(lián)合應(yīng)用后，其綜合干預(yù)效果更為顯著，其機(jī)制也與調(diào)節(jié)Wnt信號通路的活化有關(guān)，即激活經(jīng)典Wnt信號通路而抑制非經(jīng)典Wnt信號通路。提示一貫煎具有良好的調(diào)控肝臟干細(xì)胞分化方向的作用。

4 方劑的整體效應(yīng)可表達(dá)方證的關(guān)鍵病理特征

益氣的黃芪湯可顯著抑制DMN肝硬化形成期大鼠肝組織TGF-b1及a-SMA的表達(dá)，提高HGFa蛋白表達(dá)，顯示出對肝纖維化的關(guān)鍵因子具有一定的針對性，但由于對該模型此階段以KCs為中心的肝組織炎癥不但無抑制效應(yīng)，反而有促進(jìn)作用，強(qiáng)烈提示在炎性變化為主要矛盾的纖維化進(jìn)展期，僅針對纖維生成效應(yīng)細(xì)胞或關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞因子的干預(yù)是無顯著治療作用的；而茵陳蒿湯對以庫普弗細(xì)胞為中心的肝組織炎癥呈現(xiàn)顯著的抑制效應(yīng)。提示DMN肝硬化形成期大鼠肝臟以庫普弗細(xì)胞為中心的炎癥變化（纖維化發(fā)生發(fā)展的早期階段）可能是該清熱利濕茵陳蒿湯發(fā)揮干預(yù)效應(yīng)的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。

益氣的黃芪湯作用于纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子TGF-b1及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制效應(yīng)細(xì)胞的活化與轉(zhuǎn)分化，從源頭抑制纖維的異常生成；而下瘀血湯祛瘀的主要作用環(huán)節(jié)在于抑制MMP2的活性，抑制正常基膜的破壞，促進(jìn)活化的HSC凋亡，是針對肝臟纖維結(jié)締組織增生的關(guān)鍵因子，從側(cè)面驗證了氣虛血瘀為肝硬化的基本證候病機(jī)、同時也可部分詮釋肝硬化氣虛血瘀的病理生物學(xué)基礎(chǔ)，為抗器官纖維化治療的深入發(fā)展及新藥的研發(fā)提供了思路。

綜上所述，立足中醫(yī)的思維方法，緊緊圍繞“證病機(jī)及其與疾病和方劑的相關(guān)”這一中醫(yī)“證”研究的重要科學(xué)問題，以疾病證候病機(jī)相對應(yīng)的相關(guān)功效的方劑為切入點，以疾病動物模型為研究對象，對同一疾病不同造模因子的多種動物模型進(jìn)行比較對照研究，以整體藥效學(xué)為判識標(biāo)準(zhǔn)，分析探討疾病的方效證相關(guān)性，深入研究其顯效方劑的效應(yīng)病態(tài)基礎(chǔ)，探索病證相關(guān)科學(xué)基礎(chǔ)，不斷積累，可為發(fā)展中醫(yī)理論提供生物學(xué)依據(jù)，也將為治療諸多的器官纖維化探索更有效的藥物或方法。中西兩種不同醫(yī)學(xué)體系的結(jié)合與匯通是一個漫長的過程，是不斷探索、不斷修正、逐步認(rèn)識與發(fā)展的過程，中西醫(yī)結(jié)合抗肝纖維化已經(jīng)從早期的病藥結(jié)合走向具有更深內(nèi)涵的病證結(jié)合、從以肝星狀細(xì)胞為中心逐漸走向多元化，我們必須堅持科學(xué)發(fā)展觀，以科學(xué)思維方法論為先導(dǎo)，堅持以人類健康為本，以臨床療效為硬終點，重視“證據(jù)”質(zhì)量，大力推進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合肝病研究。

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