斑馬魚性腺組織的原代細胞培養技術的建立

董丹丹， 孫燕俠， 郭華榮

(中國海洋大學海洋生命學院，山東青島 266003)

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斑馬魚性腺組織的原代細胞培養技術的建立

董丹丹， 孫燕俠， 郭華榮*

(中國海洋大學海洋生命學院，山東青島 266003)

摘要[目的]建立斑馬魚卵巢和精巢組織的原代細胞培養技術，獲得原代和傳代培養細胞單層。[方法]采用組織塊貼壁法進行斑馬魚卵巢和精巢組織的原代細胞培養，采用0.25%胰蛋白酶消化法進行傳代培養。[結果]斑馬魚性腺組織的原代細胞培養條件為：最適培養基為DMEM/F12(pH 7.0～7.2)，培養溫度為24 ℃，在添加20 ng/mL 表皮生長因子(EGF)、20 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、0.5 mmol/L β-巰基乙醇和15%胎牛血清時更有利于細胞的存活。其中，卵巢的組織塊接種3～4 d后，上皮樣細胞首先開始遷出，遷出的上皮樣細胞生長5 d后，逐漸凋亡；此后，成纖維樣細胞和另一種上皮樣細胞開始大量遷出， 10 d后可生長匯合成80%的原代細胞單層；可成功傳代培養1次，但傳代后的上皮樣細胞不貼壁，很快死亡,而傳代后的成纖維樣細胞可貼壁生長，但基本不分裂，健康存活7 d后開始逐漸凋亡。精巢組織接種5 d后，上皮樣細胞和成纖維樣細胞同時開始遷出，培養16 d后逐漸凋亡，僅得到60%原代培養細胞單層。[結論]初步建立了斑馬魚性腺組織的原代細胞培養條件，并將卵巢組織塊遷出的成纖維樣細胞成功傳代1次。

關鍵詞斑馬魚；性腺組織；原代細胞培養；傳代培養

斑馬魚是原產于印度和巴基斯坦淡水河流中的一種熱帶硬骨魚，具有易于飼養、繁殖周期短、多次產卵和胚胎透明等優點，是功能基因組時代生命科學研究中最重要的一種水生模式脊椎動物[1-2]。斑馬魚作為研究模型，可用于揭示胚胎和組織器官發育的分子機理，研究和解決環境科學中的重大問題。近年來，由于環境中內分泌干擾物含量的持續增加，導致許多魚類發生性逆轉。因此，斑馬魚常被用于研究魚類的性別分化與決定以及環境內分泌干擾物的毒性機制等[3]，然而這些研究主要是基于對斑馬魚發育過程異常的觀察，過程相對繁瑣，重復性差。體外培養的斑馬魚細胞系可為此研究提供更簡便的試驗材料和手段，簡化研究過程，試驗結果重復性好。

目前，斑馬魚的肝臟細胞系[4]、胚胎細胞系[5]和脾臟細胞系[6]已成功建立，但關于建立斑馬魚性腺細胞系的研究則鮮見報道。筆者建立和優化斑馬魚生殖腺組織包括卵巢和精巢的原代和傳代細胞培養技術，旨在為今后斑馬魚性腺細胞系的建立與應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗魚4～5月齡的性成熟斑馬魚(Daniorerio)，體長約3 cm，購自青島市南山水產品市場，雌雄分開后，分別于15 L的玻璃缸中充氣暫養至少7 d，光照周期為14 h L/10 h D，水溫為25 ℃。1.2試劑胰蛋白酶(1∶250)，為Wolsen公司產品；表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)均為北京義翹神州公司產品；基礎培養基L-15和DMEM均為Gibco公司產品；基礎培養基DMEM/F12和胎牛血清(FBS)均為Hyclone公司產品；其他藥品均為分析純。

PBS配方為：8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、3 g/L Na2HPO4·12H2O、0.2 g KH2PO4。

完全培養基配方為：在基礎培養基中加入10%～20%FBS、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。

1.3原代培養方法取健康斑馬魚置于煮沸消毒的自來水中暫養4 h后，轉移至含1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL硫酸鏈霉素的煮沸消毒自來水中繼續暫養12～16 h。撈出斑馬魚后，用0.2%碘伏溶液擦拭消毒斑馬魚全身，尤其是腹部，然后，將其置于75%酒精中浸泡30 s。然后，于超凈工作臺內無菌取出卵巢或精巢組織，并將性腺組織在75%酒精中快速漂洗一下，然后轉移至含200 IU/mL青霉素和200 μg/mL硫酸鏈霉素的PBS緩沖液和基礎培養基中分別漂洗至少2遍，最后置于含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的基礎培養基中暫存。

當所有卵巢或精巢組織取完后，分別剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，漂洗干凈后，均勻接種于25 cm2細胞培養瓶(Corning公司)中，分別于20～28 ℃培養箱中密閉薄層培養18 h，然后加入3 mL含有10%～20%FBS、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-ME、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的完全培養基中進行培養，隔天補加至5 mL，此后每隔3～4 d更換50%培養液，繼續培養。每天于倒置顯微鏡(Nikon)下觀察和記錄細胞的遷出和生長狀況。

1.4傳代培養方法吸出舊培養基，然后用PE(含0.02% EDTA的PBS)緩沖液洗滌細胞，待細胞有收縮趨勢時去除PE緩沖液，加入300 μL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化至細胞開始脫落，立即加入完全培養基終止消化，用移液管吹打6～8次，然后將細胞懸液離心洗滌1次(800 r/min，離心3 min)，最后加入5 mL完全培養基重懸，平均接種到2個25 cm2細胞培養瓶中，并補加培養基至5 mL，最適溫度下繼續培養。

1.5最適培養條件的篩選

1.5.1最適培養基的篩選。比較和觀察卵巢組織小塊在3 種不同培養基(1.5×L-15、DMEM 和DMEM/F12 培養基)(pH 7.0～7.2)中的細胞遷出和增殖情況。以上3種基礎培養基中均分別添加10%FBS、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。分別于24 ℃下進行原代培養，以確定最適培養基。

1.5.2最適血清濃度的篩選。以最適培養基(DMEM/F12)為基礎培養基，于24 ℃下觀察卵巢或精巢組織小塊在3種血清濃度(10%、15%和20% FBS)的完全培養基中的細胞遷出和增殖情況，確定最適血清濃度。完全培養基中的其他添加成分相同，為20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。

1.5.3最適培養溫度的篩選。以最適培養基(DMEM/F12)為基礎培養基，以添加最適濃度的FBS(15%)、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的完全培養基，比較和觀察卵巢或精巢組織小塊在3種溫度(20、24和28 ℃) 下的細胞遷出和增殖情況，確定最適培養溫度。

2結果與分析

2.1斑馬魚卵巢組織的原代細胞培養結果由表1可知，在選用的3種基礎培養基中，1.5×L-15和DMEM培養基所培養的卵巢組織塊的貼壁率和形成細胞單層的能力均明顯低于DMEM/F12培養基，且細胞于接種5 d后才開始從組織塊中遷出；DMEM/F12培養基所培養的組織塊的貼壁率高達80%，接種3 d后即可見到細胞遷出。因此，DMEM/F12培養基更適于斑馬魚卵巢組織的原代細胞培養。

由表2可知，斑馬魚卵巢組織分別于含3種不同血清濃度(10%、15%和20% FBS)的DMEM/F12培養基中培養。當血清添加濃度為15% 時，組織塊的貼壁率和形成細胞單層的能力最高。因此，DMEM/F12培養基的最適血清濃度為15%。

表1斑馬魚卵巢組織原代細胞培養中最適培養基的篩選

Table 1Screening results of the optimal medium for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

基礎培養基Basicmedium組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細胞遷出時間Cellmigrationtime∥d形成細胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells1.5×L-15205+DMEM405+DMEM/F12803+++

注：“+” 表示少量組織塊有細胞遷出，細胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

表2斑馬魚卵巢組織原代細胞培養中最適血清濃度的篩選

Table 2Screening results of the optimal percentage of FBS for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

血清濃度Serumconcentra-tion%組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細胞遷出時間Cellmigrationtime∥d形成細胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells10603++15803+++20703++

注：“+” 表示少量組織塊有細胞遷出，細胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

由表3可知，斑馬魚卵巢組織分別于不同溫度(20、24和28 ℃)下培養，24 ℃下組織塊的貼壁率最高(80%)，細胞遷出時間最短(3 d)，形成細胞單層能力最強；20 ℃下組織塊的貼壁率與24 ℃下一樣高(80%)，但細胞遷出時間最長(7 d)，形成細胞單層的能力介于24 ℃和28 ℃之間；28 ℃下，組織塊的貼壁率最低(40%)，細胞遷出用時5 d，形成單層的能力最差。由此可見，斑馬魚卵巢組織原代細胞培養的最適溫度為24 ℃。

在最適培養條件下，于添加15%FBS、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM/F12 完全培養基中，24 ℃下斑馬魚卵巢組織塊貼壁情況良好,只有極少數組織塊脫落，懸浮于培養液中。細胞于組織塊接種3 d后開始遷出，最先遷出的是1種上皮樣細胞(圖1A)，該細胞生長5 d后開始變圓并空泡化，逐漸凋亡(圖1B)。此時，長梭形的成纖維樣細胞和多角形上皮樣細胞開始大量遷出，且可持續13天左右。其中，長梭形的成纖維樣細胞很快長成致密單層(圖1C)，但僅能健康存活20天左右；隨后，長梭形的成纖維細胞變大變薄，邊界模糊，部分細胞出現空泡化(圖1E)；后期，長梭形的成纖維細胞極度鋪展，形狀極不規則，空泡化嚴重，最終凋亡(圖1G)。多角形上皮樣細胞也在接種后20天內形成細胞單層(圖 1D)，相比之下，遷出的多角形上皮樣細胞可健康存活更長時間，在不傳代條件下，可健康存活40天左右(圖1F)，隨后，細胞逐漸變圓脫落，最終死亡(圖1H)。2.2精巢組織的原代細胞培養結果采用與卵巢組織相同的最適培養條件，斑馬魚精巢組織的原代細胞培養啟動4～5 d后，可觀察到2類細胞同時遷出，即成纖維樣細胞(圖2A)和上皮樣細胞(圖2A和圖2B)，這2類細胞均可健康存活15 d左右。接種21 d后，成纖維樣細胞開始空泡化，邊界模糊(圖 2C)；上皮細胞逐漸變圓脫落(圖2D)，在培養25 d左右時全部死亡。

表3斑馬魚卵巢組織原代細胞培養中最適培養溫度的篩選

Table 3Screening results of the optimal temperature for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

培養溫度Temperature℃組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細胞遷出時間Cellmigrationtime∥d形成細胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells20807++24803+++28405+

注：“+” 表示少量組織塊有細胞遷出，細胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細胞遷出，細胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

注：A.接種3 d后遷出的多角形上皮樣細胞；B.接種8 d后，遷出的上皮樣細胞開始變圓并空泡化，逐漸凋亡;C.接種20 d后，遷出的長梭形的成纖維細胞;D.接種20 d后，遷出的多角形上皮樣細胞;E.接種27 d后，部分成纖維細胞出現空泡化;F.接種30 d后，部分上皮樣細胞脫落;G.接種35 d后，長梭形的成纖維細胞極度鋪展，細胞變大變薄，邊界模糊，形狀極不規則，空泡化嚴重;H.接種46 d后，大部分上皮樣細胞變圓，脫落死亡。 　Note:A.The epithelium-like cells migrated from the ovary explants at 3 d post seeding.B.The migrated epithelium-like cells tends to shrink and vacuolate at 8 d post seeding.C.The fibroblast-like cells migrated from the ovary explants at 20 d post seeding.D.The epithelium-like cells migrated from the ovary explants at 20 d post seeding.E.Partial fibroblast-like cells shown in panel C showed vacolation at 27 d post seeding. F.Partial epithelium-like cells shown in panel D detached at 30 d post seeding.G.The fibroblast-like cells shown in panel C tend to over-spread out and become big,thin,irregular and vacuolated seriously at 35 d post seeding.H.Most epithelium-like cells shown in panel D begin to shrink,detach and die at 46 d post seeding.圖 1　斑馬魚卵巢組織的原代細胞培養結果Fig.1　Light micrographs of the primary culture cells derived from the ovary tissues of zebrafish

2.3傳代培養結果斑馬魚精巢組織的原代培養細胞傳代后，細胞不貼壁，未能成功傳代。卵巢組織的原代細胞培養15 d后，細胞狀態良好(圖3A)，可進行傳代。傳代后的初期階段，細胞能夠正常貼壁和生存，呈長梭形(圖3B)；中期，細胞伸展，仍可見長梭輪廓，生長緩慢，難以形成單層(圖3C)；后期，胞質內逐漸出現空泡化，最后凋亡(圖3D)。

3討論與結論

魚類細胞系可為在細胞水平上研究魚類的生理生化特性以及魚類的病毒學、免疫學、遺傳學、營養學、毒理學和內分泌學等提供有力的研究工具和手段，而性腺細胞系對研究生殖干細胞的自我更新以及配子形成具有重要意義。Wolf等[7]于1962 年建立了世界上第1個魚類性腺組織細胞系——虹鱒魚性腺細胞系(RTG-2)。性腺組織的有絲分裂水平較高，已報道的魚類性腺細胞系已有20余種[8-9]，但迄今為止尚未見到斑馬魚性腺組織細胞系的成功報道。筆者首次優化和建立了斑馬魚卵巢和精巢組織的原代和傳代培養技術，為今后成功建立斑馬魚性腺組織細胞系奠定了基礎。

注：A.接種5 d后，遷出的上皮樣細胞(e)和成纖維樣細胞(f);B.接種5 d后，遷出的上皮樣細胞;C.接種21 d后，空泡化的成纖維樣細胞;D.接種21 d后，開始脫落死亡的上皮樣細胞。　Note:A.The migrated epithelium-like cells (e) and fibroblast-like cells (f) at 5 d post seeding; B.The migrated epithelium-like cells at 5 d post seeding; C.The fibroblast-like cells shown in panel A demonstrated vacuolation at 21 d post seeding; D.The epithelium-like cells shown in panel B began to detach and die at 21 d post seeding.圖2　斑馬魚精巢組織的原代細胞培養結果Fig.2　Light micrographs of the primary culture cells derived from the testis tissues of zebrafish

注：A.傳代前的原代細胞單層;B.傳代3 d后的細胞;C.傳代7 d后的細胞;D.傳代10 d后的成纖維樣細胞。　Note:A.Primary ovary cells before subculture; B.Cells at 3 d after subculture; C.Cells at 7 d after subculture; D.Cells at 10 d after subculture.圖3　斑馬魚卵巢組織原代培養細胞的傳代Fig.3　Subculture of primary ovary cells of zebrafish

魚類原代細胞培養過程中的消毒處理和無菌取材是培養能否成功的關鍵。筆者通過以下措施成功實現了試驗材料的完全無菌：①試驗前24 h停止喂食，并轉移到煮沸消毒過的自來水中暫養4 h，然后再將斑馬魚轉移至含雙抗(1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL硫酸鏈霉素)的煮沸消毒的自來水中暫養12～16 h，這樣就在極大程度上控制了微生物和原生動物的污染；②解剖前用碘伏擦拭斑馬魚體表，然后再用75%的酒精浸泡約30 s，進一步去除體表的微生物和原生動物，并使其麻醉；③取出的生殖腺再用75%的酒精漂洗2～3 s，然后再依次用含200 IU/mL青霉素和200 μg/mL硫酸鏈霉素的PBS及基礎培養基漂洗，以除去組織塊表面殘留的酒精成分，避免由于酒精損傷組織而降低細胞的貼壁能力和存活率。

組織塊貼壁培養法是一種常用的簡便易行的原代細胞培養方法，因其組織塊未受太大的破壞，所以與體內環境比較接近，可在短期內保持貼壁能力和增殖能力，并形成生長暈。此外，這種方法操作步驟簡單、一般不會造成污染[10]。筆者采用組織塊貼壁法成功啟動了斑馬魚卵巢組織的原代細胞培養，細胞一般在原代培養啟動后3～4 d內即可見到上皮樣細胞開始遷出，5 d后該上皮樣細胞停止遷出，并開始空泡化；與此同時，長梭形的成纖維樣細胞和另一種上皮樣細胞開始遷出，10 d后可形成細胞單層，并可以成功傳代1次。傳代后的細胞不生長分裂，這可能與培養基中某種生長因子的缺乏有關，尚需進一步研究。

筆者通過比較斑馬魚卵巢組織細胞在1.5×L-15、DMEM 和DMEM/F12 3種培養基中組織塊的遷出、貼壁及增殖情況，發現DMEM/F12(pH7.0～7.2)是適宜斑馬魚卵巢組織細胞體外培養的培養基，這與斑馬魚胚胎細胞系(ZF4)[5]的最適培養基相同，可能與DMEM/F12培養基的營養成分比較豐富有關。

血清中含有各種生長因子和激素等有助于細胞貼壁和生長的物質，其添加濃度是體外細胞培養能否成功的重要因素。該研究發現含15% FBS的培養基最適合斑馬魚性腺細胞的體外培養，而含10% 和20%FBS的的培養基均不適合斑馬魚生殖腺細胞的培養，可能與血清中的某些生長因子的濃度過低和過高，抑制細胞的增殖有關[11]。

該研究還發現斑馬魚性腺細胞體外培養的最適溫度為24 ℃，而斑馬魚肝臟細胞系(ZFL)[4]和ZF4細胞系[5]的最適培養溫度分別為26和28.5 ℃。這說明魚類作為變溫動物，不同組織來源的細胞的培養條件可能有所差異。

任國誠等[12]在培養漠斑牙鲆胚胎細胞和樊廷俊[13]等在培養褐點石斑魚細胞時均添加了一定濃度的bFGF，有效促進了細胞的有絲分裂，這是由于bFGF與酪氨酸激酶受體結合后激活了Ras蛋白，從而激活MAP酶級聯反應，最終使細胞進入分裂期，引起細胞增殖[14]；EGF也能夠促進細胞有絲分裂[15]。此外，有研究證實EGF和bFGF能夠促進斑馬魚細胞的有絲分裂[16-18]。筆者在培養基中添加了20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF，發現這2種生長因子也有效促進了斑馬魚性腺細胞的體外培養。該研究結果還表明年幼的斑馬魚的性腺組織細胞的遷出量遠遠高于年長斑馬魚，這是因為年幼組織的細胞具有較強的增殖能力。因此，試驗材料的來源對于斑馬魚性腺組織的原代細胞培養順利與否也很重要。

總之，該研究所建立的斑馬魚性腺組織原代和傳代培養條件，為今后斑馬魚性腺組織細胞系的建立、斑馬魚生殖干細胞的培養、基因功能研究以及環境內分泌干擾物的毒性檢測等奠定了良好基礎。

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基金項目國家自然科學基金項目(31472274，31172391)；海洋經濟創新發展區域示范項目(12PYY001SF08)；中國海洋大學本科生SRDP項目。

作者簡介董丹丹(1991- )，女，山東荷澤人，碩士研究生，研究方向：細胞生物學。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事海洋生物分子細胞生物學研究。

收稿日期2016-04-27

中圖分類號S 917

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-130-05

Development of Primary Cell Culture from the Gonad Tissues of Zebrafish

DONG Dan-dan,SUN Yan-xia,GUO Hua-rong*

(College of Marine Life,Ocean University of China,Qingdao,Shandong 266003 )

Abstract[Objective] To develop a primary cell culture system for the cells from ovary and testis tissues of zebrafish and to obtain the corresponding cell monolayer of both primary culture and subculture.[Method] Primary cell cultures were derived using the explants culture method.The primary cells were sub-cultured by 0.25% trypsin digestion.[Result] The zebrafish gonad-derived cells were cultured in DMEM/F12 (pH 7.0-7.2) at an optimal temperature of 24 ℃.The cells had better growth and survivor when the medium mentioned above was supplemented with 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF),20 ng/mL basic fibroblast factor (bFGF),0.5 mmol/L β-mercaptoethanol and 15% fetal bovine serum (FBS).For ovary tissues,epithelium-like cells first migrated from the explants at 3～4 days after seeding.These epithelium-like cells could only survive for about 5 days in vitro,and then tended to apoptosis.However,active migration of fibroblast-like cells and another kind of epithelium-like cells were then observed and a primary cell monolayer with 80% confluence could be formed within 10 days.Then the primary cell monolayer could be successfully sub-cultured once.The epithelium-like cells can’t re-attach and die soon after subculture.However,the re-attached fibroblast-like cells could healthily survive for another 7 days and then tend to apoptosis.No obvious cell division was observed in both the primary and subculture cells.For testis tissues,both epithelium-like cells and fibroblast-like cells migrated from the explants at 5 days after seeding.At 16 days after seeding,a primary cell monolayer with 60% confluence was obtained and then tended to apoptosis.[Conclusion] This study has established a primary cell culture system suitable for the gonad tissues of zebrafish,and the fibroblast-like cell monolayer derived from the ovary tissues has been successfully sub-cultured for one time.

Key wordsZebrafish; Gonad tissue; Primary cell culture; Subculture