養殖水體添加嗜酸小球菌對鱖發育過程腸道微生物構成的影響

夏　耘,余德光,謝　駿,王廣軍,郁二蒙

(中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州　510380)

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養殖水體添加嗜酸小球菌對鱖發育過程腸道微生物構成的影響

夏耘,余德光,謝駿,王廣軍,郁二蒙

(中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州510380)

摘要：從鱖(Siniperca chuatsi)出膜仔魚階段開始向養殖水體添加5×107 CFU/L的嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)，利用PCR-DGGE技術對鱖受精卵、出膜仔魚、仔稚魚和其開口餌料白鰱仔稚魚的腸道微生物群落結構組成和多樣性進行了分析。DGGE圖譜的條帶克隆測序結果顯示，組成鱖魚苗各階段的細菌主要隸屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、黃桿菌綱(Flavobacteria)。其中黃桿菌屬(Flavobacterium)為鱖受精卵特有細菌；異常球菌屬(Deinococcus)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)是受精卵和仔魚共有優勢細菌，但在仔稚魚中沒有或只有極少分布；腸桿菌屬(Enterobacter)是鱖仔稚魚和開口餌料白鰱仔稚魚的共有優勢細菌；類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)和豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)在對照組仔稚魚的分布明顯比試驗組豐富。

關鍵詞：嗜酸小球菌(Pediococcus acidilactici)；鱖(Siniperca chuatsi)；腸道微生物

鱖(SinipercachuatsiBasilewsky)，又名胖鱖、季花魚、桂魚，屬鱸形目脂科鱖屬，是廣泛分布于我國南北水域的肉食性兇猛魚類，其肉嫩味美，為淡水魚類珍品。鱖養殖生產中首先面臨的是苗種培育高成本和低成活率的問題。研究顯示，在仔魚階段，當魚類的嘴張開后，腸道成了與外部環境聯系的最重要場所，是致病菌侵入的主要途徑。但同時益生菌也可進入腸道，形成第一道對抗有害菌入侵的屏障[1]。在仔魚早期，腸道內的益生菌可誘導免疫系統的發育，激活宿主的免疫活力；益生菌和魚類寄主可通過協同作用，促進形成健康而穩定的微生物群系，并合力維持這個微生物群系的動態平衡，使這個群系能夠發揮出強大的益生作用[2]。本試驗通過向鱖魚苗培育水體添加嗜酸小球菌(Pediococcusacidilactici)，利用PCR-DGGE技術檢測鱖魚苗發育各階段腸道微生物群落組成和結構變化，為應用嗜酸小球菌來改變鱖魚苗種的細菌群落構成，提高苗種免疫力，獲得較高成活率提供基礎理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本次試驗樣品采自廣東清遠清新縣宇順農牧漁業科技服務有限公司，池塘面積為20 m2，水溫為25～28 ℃，溶氧為4.5～8.5 mg/L，pH 7.1～8.1，并且從仔稚魚階段開始向養殖水體放養開口餌料白鰱供其攝食。試驗組從鱖魚苗種培育過程的出膜仔魚階段開始向養殖水體添加 5×107CFU/L的嗜酸小球菌，對照組不添加嗜酸小球菌，每組分別設置三個平行。在受精卵、出膜仔魚和仔稚魚三個階段采樣，并采集本試驗中稚魚的開口餌料白鰱，充氧帶回試驗室。各階段樣品經0.65%無菌生理鹽水沖洗三遍，用2 mL滅菌離心管收集，置于-40 ℃保存備用。

1.2微生物基因組DNA提取

樣品細菌總DNA的提取采用Bacterial DNA Kit試劑盒(Omega，美國),具體步驟完全參照試劑盒說明。總DNA用1%瓊脂糖檢測，-20 ℃保存備用。

1.3細菌PCR-DGGE及序列分析

采用針對16S rDNA基因的通用引物(F338-GC和R534)對3個時間點的樣品微生物進行PCR-DGGE指紋分析[3]，其中 16S rDNA目的片段的變性梯度范圍為30%～60%[4]。電泳溫度控制在60 ℃， 200 V預電泳5 min， 110 V電泳12 h。電泳結束后，在室溫條件下用稀釋10 000倍的Genefinder核酸染料搖床上染色30 min。用BIO-RAD 成像系統獲得DGGE圖譜，并對圖譜中的部分條帶進行克隆測序。

1.4數據分析

利用BIO-RAD Quantity One 軟件獲取DGGE圖譜的數字化信息，微生物群落結構的相似性通過Dice相似系數來比較，非加權配對算術平均法聚類(UPGMA) 和主成分分析(PCA)由軟件XLSTAT-Pro 來完成。

2結果與分析

2.1PCR-DGGE指紋圖譜構建及分析

獲得鱖苗種培育受精卵、出膜仔魚、仔稚魚三個階段及其開口餌料白鰱仔稚魚微生物16S rDNA基因的DGGE指紋圖譜(圖1)。其中鱖受精卵獲得22條可鑒別譜帶，對照組和試驗組出膜仔魚均獲得21條可鑒別譜帶，對照組和試驗組仔稚魚均獲得13條可鑒別條帶，餌料白鰱仔稚魚獲得11條可鑒別條帶。鱖受精卵微生物譜帶最多，而仔稚魚獲得最少的微生物譜帶。

依據DGGE指紋譜帶的豐富度和峰值分別對各樣品的細菌群落結構進行基于Dice系數的UPGMA聚類分析。如圖2所示，餌料白鰱仔稚魚微生物構成單獨聚為一支；鱖受精卵和出膜仔魚(包括對照組和試驗組)聚為一支；鱖對照組和試驗組仔稚魚聚為另一支。由于白鰱仔稚魚來自同一養殖場，養殖水源條件相同，而白鰱仔稚魚與鱖苗種各階段微生物構成相似度最低，說明這可能與品種有關。另外出膜仔魚微生物群落構成和受精卵微生物群落構成單獨聚在一起，說明出膜仔魚微生物群落構成和受精卵的相似性高，受受精卵微生物構成影響較大。而仔稚魚的微生物群落構成受受精卵本身及其攝食的開口餌料鰱兩者影響，變化較大。受精卵以后的各發育階段樣品的對照組和試驗組之間微生物構成存在差異，說明向水體添加嗜酸小球菌改變了鱖苗種的細菌群落構成。

DGGE圖譜PCA分析結果如圖3所示。樣品之間的距離代表了它們的差異大小。各樣品微生物主成分因子1(PC1)的貢獻率為33.18%，主成分因子2(PC2)的貢獻率為27.19%。鱖受精卵的微生物構成與其它各組之間差異較大；鱖仔稚魚的微生物構成受開口餌料鰱仔稚魚的影響較大，兩者在PC2方向上分布較集中，說明開口攝食后，鱖仔稚魚腸道微生物構成受攝食餌料的影響較大；各階段樣品的對照組和試驗組在PC1方向上分布均較分散，說明添加嗜酸小球菌對腸道微生物的構成產生了影響。

圖1　鱖受精卵、出膜仔魚、仔稚魚及白鰱仔稚魚細菌群落16S rDNA的PCR-DGGE指紋圖譜

圖2　鱖魚受精卵、出膜仔魚、仔稚魚及白鰱仔稚魚樣品DGGE指紋圖譜聚類分析(UPGMA)

圖3　鱖受精卵、出膜仔魚、仔稚魚及白鰱仔稚魚樣品細菌群落PCA分析

2.2目的條帶的克隆與測序

為了進一步分析鱖受精卵不同階段的細菌群落結構和多樣性，對圖1DGGE圖譜中三角形標記的19個條帶進行割膠回收、克隆測序。最終得到19個序列的陽性克隆(表1)，經GenBank數據庫比對，發現隸屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、黃桿菌綱(Flavobacteria)。條帶4代表的黃桿菌屬(Flavobacterium)為鱖受精卵特有。條帶7和8代表的紅桿菌屬(Rhodobacter)主要存在于鱖受精卵，在仔魚和仔稚魚中只有極少存在。條帶2和條帶5代表的異常球菌屬(Deinococcus)和菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)是鱖受精卵和仔魚的共有優勢細菌。條帶3代表的異常球菌屬(Deinococcus)在受精卵、仔魚及仔稚魚中都存在，但是在仔稚魚中量很少。條帶6代表的腸桿菌屬(Enterobacter)是鱖仔稚魚和開口餌料鰱仔稚魚的共有優勢細菌，說明鱖仔稚魚腸道細菌中這類菌的存在來自于其開口餌料鰱仔稚魚，條帶12表示的Deinococcusdaejeonensis是鱖受精卵和仔魚的共有細菌，且是受精卵的優勢菌，在仔稚魚中不存在。條帶13代表的紅桿菌屬是鱖受精卵和仔魚的共有優勢細菌。條帶15表示的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是鱖仔魚和仔稚魚特有細菌，且在仔魚階段的分布明顯比仔稚魚階段豐富。條帶16、17和條帶18代表的類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)和豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)在對照組仔稚魚的分布明顯比試驗組豐富。

表1　鱖魚苗發育不同階段細菌群落DGGE目的條帶的克隆測序結果

續表1

3討論

魚類在不同的生長發育階段其腸道微生物菌群組成和數量均有所不同，與其它動物一樣，也存在著不同菌群的定植演替過程[5]。例如馬蘇大麻哈魚(Oncorhynchusmasou)和大麻哈魚(O.keta)的腸道正常菌群在仔魚后期，受精卵黃被吸收，消化道活化后便建立了[6]。本次研究中黃桿菌屬是鱖受精卵的特異細菌(條帶4)；紅桿菌屬主要存在鱖受精卵或仔魚階段，在仔稚魚中不存在或只有極少存在(條帶7、8和13)。和其它魚類一樣，鱖有屬于其發育各階段的特征性菌群。

腸道是魚類消化食物和吸收養分的場所，同時，腸道細菌的大部分營養也是依靠魚類組織液或分解食物團而獲得，所以餌料類型影響魚類腸道微生物的組成[7]。魚類在仔魚期、仔稚魚期和幼魚期這三個階段中，腸道內微生物菌群的組成會隨著飼料的變化產生較快的變化[8]。魚類只有在開始進食后才能檢測到腸道內細菌的存在，并且細菌群落的組成和食物細菌組成相似[9-10]。本次研究中條帶6代表的腸桿菌屬僅存在鱖魚的開口仔稚魚階段及其開口餌料鰱魚仔稚魚，其它樣品中均沒有檢測到其存在，說明腸桿菌屬在鱖魚苗腸道的存在與其攝食有關，由開口餌料白鰱仔稚魚帶入。

許多研究表明，益生菌類物質在養殖水體中的添加能夠提高魚類的生產性能、飼料利用率和免疫能力[11]。其起作用的主要途徑是通過改善宿主腸道微生物生態平衡而對宿主動物發揮有益作用。在水體中使用微生態制劑可影響魚類腸道菌群的組成[12-13]。本研究中向水體添加嗜酸小球菌后試驗組鱖魚仔稚魚腸道類志賀鄰單胞菌和豚鼠氣單胞菌的量明顯減少。類志賀鄰單胞菌在水體、魚類、多種哺乳動物及人類腸道中發現，能引起感染性腹瀉，是一種重要的腸道致病菌，能引起食物中毒；豚鼠氣單胞以往認為為低毒性的條件致病菌，僅引起機會性感染[14-15]。本研究中并沒有檢測到嗜酸小球菌在試驗組鱖魚苗中的存在，其原因可能與PCR-DGGE技術本身存在的缺陷[16]或本次實驗選擇目的條帶時將一些非優勢條帶忽略有關。其次，水產養殖益生菌的應用給水產養殖帶來的有益影響，其產生作用的機制可能是多方面的，通過在腸道定植來改善腸道內環境只是途徑之一，也可以通過改善水質及其它一些生理條件來改善腸道內環境，促進機體健康生長。所以在以后的研究中，我們可以對嗜酸小球菌產生作用的機制進行進一步研究，闡明其抑制腸道有害菌群繁殖的具體原因。本次試驗中，嗜酸小球菌的使用抑制了鱖仔稚魚腸道內有害菌群的繁殖，是鱖苗種培育潛在的益生菌。

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(責任編輯：鄧薇)

收稿日期：2015-06-02；

修訂日期：2016-01-12

第一作者簡介：夏耘(1986- )，女，碩士，研究方向水產健康養殖。 E-mail：xiayun412@126.com 通訊作者：余德光。E-mail:gzhyudeguang@163.com

中圖分類號：S963.21

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0071-06

The effects of Pediococcus acidilactici on intestinal microbial of Siniperca chuatsi fry

XIA Yun,YU De-guang,XIE Jun,WANG Guang-jun,YU Er-meng

(KeyLaboratoryofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,MinistryofAgriculture/PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScienes,Guangzhou510380,China)

Abstract：5×107 CFU/L Pediococcus acidilactici was added in the culture water of Siniperca chuatsi from the new-hatched larvae stage.Microbial communities of fertilized eggs,new-hatched larvae,juveniles and initial feed Hypophthalmichthy smolitrix juveniles were analyzed by using the PCR-DGGE (PCR-denaturing gradient gel electrophoresis) technology.The results showed that the main microbes represented by main bands in DGGE gel were Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria,Flavobacteria and Deinococci.Among these bacteria, Flavobacterium was specific bacteria in S.chuatsi fertilized eggs. Deinococcus,Rhodobacter and Pseudomonas cichorii were the main bacteria which existed in both fertilized eggs and new-hatched larvae,but these three kinds of bacteria did not exist or seldom existed in juveniles. Enterobacter was common dominant bacteria of S.chuatsi juveniles and initial feed Hypophthalmichthy smolitrix juveniles.Distribution of Plesiomonas shigelloides and Aeromonas caviae was much more abundant in control group juveniles than in experimental group juveniles.

Key words：Pediococcus acidilactici；Siniperca chuatsi；intestinal bacteria

資助項目：“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2012BAD25B04);公益性行業(農業)科研專項(201203083);廣東省海洋漁業科技推廣專項(B201201A05)