哲羅鮭胰島素樣生長因子-I(IGF-I)cDNA分子克隆、序列分析及組織表達

王曉玉，紀　鋒，徐黎明，趙景壯，劉　淼，曹永生，尹家勝

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱　150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海　201306)

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哲羅鮭胰島素樣生長因子-I(IGF-I)cDNA分子克隆、序列分析及組織表達

王曉玉1,2，紀鋒1,2，徐黎明1，趙景壯1，劉淼1，曹永生1，尹家勝1

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海201306)

摘要：采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法，從哲羅鮭(Hucho taimen)肝臟的總RNA中擴增出胰島素樣生長因子-I(IGF-I)的cDNA開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列，運用軟件對其進行生物信息學分析，并利用熒光實時定量PCR技術檢測了哲羅鮭成魚不同組織中IGF-I mRNA的表達情況。結果顯示，IGF-I 基因的cDNA開放閱讀框為573 bp，編碼190個氨基酸，蛋白質等電點為9.21，氨基酸結構由信號肽、B、C、A、D結構域及E肽組成；氨基酸序列與其他鮭科魚類具有較高的同源性，其中與北極紅點鮭的IGF-I同源性最高(99.2%)；組織表達分析顯示，哲羅鮭IGF-I mRNA在肝臟中表達量最高，在鰓、前腸中次之，在腦、頭腎、脾、心、胃和肌肉等組織中的表達量較低。

關鍵詞：哲羅鮭(Hucho taimen)；胰島素樣生長因子-I(IGF-I)；進化樹；組織表達

哲羅鮭(Huchotaimen)又稱哲羅魚，屬鮭形目(Samoniformes)鮭科(Salmonidae)哲羅魚屬(Hucho)，是名貴的大型冷水性魚類，具有較高的經濟價值。近年來，由于哲羅鮭生態環境遭到破壞，資源下降，導致種群數量減少[1]。國內外對于哲羅鮭的研究主要集中在區域變化、遺傳育種、種群結構等方面，但對于分子生理學，尤其是胰島素樣生長因子(IGF)系統的研究較少。

魚類胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factors,IGF)是一類具有胰島素樣代謝和促進有絲分裂功能的多肽，包括IGF-I和IGF-II，但近年來Wang等研究羅非魚發現新成員IGF-III[2]。IGF-I具有調節細胞代謝，促進細胞生長、分化和分裂，抑制細胞死亡和調節滲透壓等多種生理功能[3-4]。對哲羅鮭的IGF-I基因進行深入研究，在哲羅鮭的育種及養殖管理等方面都具有重要的指導作用。魚類IGF-I主要在肝臟中合成，并由GH調節，但IGF-I不僅在肝臟中表達，在腦、腸、鰓、腎等組織中也有表達，而且大都是通過自分泌和旁分泌方式釋放[5]，其主要在胚后發育和成年期發揮促生長作用[6]。目前，魚類中已經有牙鲆[7]、尼羅羅非魚[8]、斑馬魚[9]和馬蘇大馬哈魚[10]等硬骨魚類獲得了IGF-I cDNA部分及全長基因序列，揭示了IGF-I在進化過程中的保守性。

本研究克隆獲得了哲羅鮭IGF-I基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)序列，對其進行了生物信息學分析，并運用實時熒光定量PCR技術對哲羅鮭心臟、肝臟、頭腎、脾、胃、前腸、后腸、鰓、腦和肌肉等十種組織的IGF-I mRNA表達水平進行了分析，為進一步了解IGF-I基因的功能和作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗用哲羅鮭采自中國水產科學院黑龍江水產研究所渤海冷水魚試驗站，為2齡魚，體重約0.75 kg。

一步法RT-PCR試劑盒、PCR試劑、Taq聚合酶、DNA Marker、pMD18-T simple Vector、限制性內切酶及SYBR?premix Ex TaqTMII(Tli RnaseH Plus)均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒及SV Total RNA Isolation kit購自Promega公司；First Strand cDNA Synthesis Kit (ReverTra Ace-α-)試劑盒購自TOYOBO公司。

1.2引物設計與合成

對Genbank收錄的多條鮭鱒魚IGF-I基因開放閱讀框序列進行比對，然后選擇北極紅點鮭的IGF-I基因開放閱讀框序列(NCBI登錄號為：GU933431.1)為模板，利用Primer5.0設計用于擴增哲羅鮭ORF序列的引物P-F、P-R，分別在上、下游引物的5′端添加了BsaI 和BamH I酶切位點(酶切位點見下劃線標識)。

根據擴增出的哲羅鮭的IGF-I基因開放閱讀框，設計用于熒光定量PCR的引物IGF-I-F、IGF-I-R。引物均由博仕生物技術有限公司合成(見表1)。用于熒光定量PCR的內參引物β-actin-F、β-actin-R和18s-F、18s-R，是由豐程程[11]根據擴增出的哲羅鮭的β-actin和18s基因的片段而設計的用于做熒光定量的內參引物。

表1　引物序列及退火溫度

注：下劃線部分為引入的酶切位點

1.3IGF-I基因克隆

1.3.1IGF-I基因的獲得

按照Promega公司SV Total RNA Isolation System試劑盒的方法提取2齡哲羅鮭肝臟總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量和濃度。按照TOYOBO公司First Strand cDNA Synthesis Kit (ReverTra Ace-α-) 試劑盒的方法對提取后的RNA進行RT-PCR一步反應擴增IGF-I基因。取5 μL PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.2產物純化及測序

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR產物進行回收純化。純化產物與pMD18-T simple Vector連接構建重組質粒，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經LB平板倒置培養后，挑取單菌落培養并進行PCR鑒定。選擇陽性克隆送哈爾濱博仕生物技術有限公司測序。

1.4IGF-Ⅰ基因的序列分析

在NCBI的Genbank數據庫中搜索脊椎動物IGF-I的氨基酸序列，利用Clustal X軟件和MEGA5.0軟件對哲羅鮭及十九種脊椎動物IGF-I氨基酸序列進行多重對比，并采用Neighbor-Joining法(1 000 runs,Amino:p-distance)構建系統進化樹。用于IGF-I核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析及進化樹構建的物種名稱和登錄號列于表2。

表2　本研究所用物種IGF-I的NCBI登錄號

1.5IGF-I組織表達情況分析

分別取三尾2齡哲羅鮭的心臟、肝臟、頭腎、脾、胃、前腸、后腸、鰓、腦和肌肉組織，于液氮中迅速冷凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。運用Trizol方法提取各組織RNA，首先將組織在液氮中研磨成粉末，取100 mg組織粉末，加入1 mL Trizol冰上裂解；加0.2 mL氯仿進行抽提；取400 μL上清液，用0.5 mL異丙醇沉降RNA，再用1 mL 75%乙醇洗滌去除雜質；用DEPC水溶解RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，并用紫外分光光度計測定RNA的A260∶A280值和RNA濃度。按照PremeScriptTMRT reagent Kit操作方法去除組織DNA，將RNA定量至1 μg，進行反轉錄。

把各組織cDNA按一倍稀釋，按照SYBR premix Ex TaqTMII (Tli RnaseH Plus) 試劑盒操作方法配制反應液，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行PCR反應。以哲羅鮭的脾作為參照，每個組織設置3個重復。擴增參數為：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環數40個。運用2-△△Ct法計算基因表達量，所有數據以平均相對量展現(Means±SD)。

2結果與分析

2.1哲羅鮭IGF-I基因片段的克隆

哲羅鮭肝臟總RNA經過RT-PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，發現在500～750 bp之間有一明顯條帶，與預期的目的條帶大小相符(573 bp)(圖1)。將PCR產物純化回收后與pMD18-T simple Vector連接，并利用BsaI/BamH I對重組質粒pMD18-T-IGF-I進行酶切鑒定(圖2)。將鑒定正確的pMD18-T-IGF-I進行測序鑒定，得到開放閱讀框(ORF)長度為573 bp的IGF-I基因片段，在NCBI上BLAST分析后發現此基因片段與北極紅點鮭的IGF-I基因同源性高達99%，判斷出此序列是哲羅鮭IGF-I基因。

圖1　IGF-I基因擴增產物電泳圖

圖2　IGF-I重組質粒酶切鑒定

1.IGF-I重組質粒；2.雙酶切后的IGF-I重組質粒；M.DL2000分子標準

2.2哲羅鮭IGF-I基因的氨基酸結構分析

本研究獲得的哲羅鮭IGF-I基因的cDNA開放閱讀框為573 bp，編碼含190個氨基酸的蛋白質(圖3)。利用Protean軟件預測確定IGF-I蛋白的相對分子質量為21.01 kDa，等電點為9.21。對IGF-I的氨基酸結構進行比對分析發現，哲羅鮭的IGF-I與其他鮭鱒魚類結構相似，其由信號肽、B、C、A、D結構域和E肽組成。其中信號肽含有46個氨基酸殘基、E肽含有74個氨基酸殘基，而B、C、A、D結構域分別含有29、12、21、8個氨基酸殘基。

2.3哲羅鮭IGF-I基因序列的系統進化分析

對比二十個物種的氨基酸序列發現，哲羅鮭的IGF-I氨基酸序列與斑鱒、北極紅點鮭、大西洋鮭、虹鱒、鮭魚的同源性為99.4%～96.3%。因此鮭科魚類的IGF-I基因相對保守，而與其他硬骨魚類的同源性在87.7%～82.9%之間。哲羅鮭的IGF-I氨基酸序列與金倉鼠、綠頭鴨、人、中華鱉、野豬及牛等其他6種動物的同源性最低，僅72.5%～66.4%(見圖4所示)。

圖3　哲羅鮭IGF-I ORF的cDNA和氨基酸序列

圖4　哲羅鮭IGF-Ⅰ氨基酸序列與其他物種IGF-I同源性比較

基于以上獲得的氨基酸序列，利用Mega5.05軟件，以鄰位相連法(Neighbor-joining)構建NJ系統進化樹(見圖5)。結果與同源性的分析相一致，哲羅鮭與斑鱒、北極紅點鮭、大西洋鮭、虹鱒、鮭魚聚類為一枝，說明哲羅鮭IGF-I與鮭鱒魚IGF-I的親緣關系較近，與其他硬骨魚類的分化較遠。整個魚類作為一個大枝聚類在一起，與此相對的是其他幾種非魚類脊椎動物聚為一個大枝，說明哲羅鮭IGF-I與哺乳類、鳥類及兩棲類等親緣關系較遠。該系統進化樹中的各物種親緣關系與其傳統地位相一致。

圖5　IGF-Ⅰ氨基酸序列的NJ系統進化樹

2.4哲羅鮭IGF-I的組織表達分析

利用實時熒光定量PCR分析哲羅鮭IGF-I基因在不同組織中的表達情況，本研究以18S及β-actin作為內參基因對各組織起始RNA進行校正。對哲羅鮭不同組織IGF-I基因及18S和β-actin進行實時熒光定量實驗，分別進行3組重復，以脾組織作為對照，采用2-△△Ct法分析不同組織中IGF-I mRNA的相對表達量。結果顯示，哲羅鮭IGF-I mRNA在所有被檢測組織中均有表達，其中在肝臟中的表達量最高，鰓中的表達量次之，在肌肉中的表達量最低。(圖6)

圖6　哲羅鮭各組織IGF-I mRNA的相對表達含量

3討論

本研究成功克隆獲得了哲羅鮭IGF-I基因的開放閱讀框，大小為573bp，編碼190個氨基酸。對實驗結果進行生物學分析，顯示哲羅鮭IGF-I序列與虹鱒IGF-I序列結構相似[12]，包括信號肽、B、C、A、D結構域及E肽三部分，且含有6個半胱氨酸殘基。6個半胱氨酸殘基可形成3對二硫鍵，從而形成穩定的結構并保持相應的功能。但哲羅鮭IGF-I成熟肽的第27位氨基酸殘基與虹鱒不同，且哲羅鮭IGF-I的E肽所含氨基酸殘基比虹鱒多12個，這可能是哲羅鮭與虹鱒產生差異的原因之一。氨基酸序列同源性比對分析發現哲羅鮭IGF-I與北極紅點鮭IGF-I同源性最高，為99.4%，與其他鮭科魚類的同源性也均在96%以上。而與其他硬骨魚類的同源性較低，在87.7%～82.9%之間，與金倉鼠、綠頭鴨、人、中華鱉、野豬及牛等其他動物的同源性最低，僅72.5%～66.4%。同樣，系統進化樹的結果顯示與同源性分析結果一致，且進化樹的結構與傳統分類學的結論相一致。IGF-I在不同魚類間的高度保守性說明其在進化過程中始終保留著重要的功能結構，但是根據自身的身體條件以及生長環境的影響也發生了一定的變異。

本研究利用熒光定量PCR檢測了哲羅鮭十種組織中IGF-ImRNA的相對表達量，結果顯示，IGF-I在肝臟中的表達量最高，這與已研究過的花鱸[13]、日本白鯽[14]、波紋短須石首魚[15]和銀大馬哈魚[16]的結果相似。肝臟是分泌IGF-I的主要部位，但IGF-I的表達也呈現出多樣性，例如本實驗結果顯示哲羅鮭IGF-I在脾、心、腎、腸以及肌肉等組織中也有少量表達，甚至有研究者在大麻哈魚的脂肪中也檢測到有IGF-I的表達[17]。表明魚類IGF-I通過這些組織細胞的自分泌和旁分泌而作用于自身組織細胞發揮生理作用。哲羅鮭IGF-I在肌肉、后腸等組織中的表達量不是十分明顯，出現此種情況的原因有很多，可能是IGF-I的表達受多種因素的調控所致，例如激素水平、營養狀況、生長環境等因素的調控；也可能是個體差異所致。

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(責任編輯：張瀟峮)

收稿日期：2015-06-23；

修訂日期：2016-03-17

第一作者簡介：王曉玉(1989-)，女，碩士，從事水產動物繁殖生理學研究。E-mail:xyw7913@163.com 通訊作者：尹家勝。E-mail:xwsc20@tom.com

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0019-06

Cloning,sequence analysis and tissue expression of insulin-like growth factor I in Hucho taimen

WANG Xiao-yu1,2,JI Feng1,2,XU Li-ming1,ZHAO Jing-zhuang1,LIU Miao1,CHAO Yong-sheng1,YIN Jia-sheng1

(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：Total RNA was isolated from Hucho taimen liver tissue.The cDNA encoding insulin-like growth factor I (IGF-I) peptide was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) strategy using isolated total RNA as template.The IGF-I mRNA level was detected in different tissues using real-time quantitative PCR technique.The results displayed that the IGF-I contained an open reading frame (ORF) of 573 bp,and encoded a polypeptide with length of 190 amino acids.The polypeptide was composed of signal peptide,B,C,A,D domain and E peptide and the isoelectric point was 9.21.The amino acid sequence of H.taimen IGF-I was high homologus to that of other Salmonidae. H.taimen shared the highest identity with Salvelinus alpinus and the homology at nucleotide level of the IGF-I gene was 99.2%.The expression analysis of IGF-I gene with real-time quantitative RT-PCR showed that the highest level of IGF-I mRNA was observed in liver,followed by in gill and anterior intestine.There was no obvious expression in brain,pronephros,spleen,heart,stomach and muscle.

Key words：Hucho taimen;IGF-I;evolutionary trees;tissue expression

資助項目：國家科技支撐計劃(2012BAD25B10)；公益性行業(農業)科研專項(201003055-14)