低分子量肝素鈉佐劑對甲型肝炎病毒疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響

王　瑋，余柄廷,李建芳，李彥涵，劉麗君，胡凝珠

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明　650118；2. 河北大學生命學院，河北 保定　071000；3.昆明醫科大學，昆明　650500)

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低分子量肝素鈉佐劑對甲型肝炎病毒疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響

王瑋1，余柄廷2,李建芳1，李彥涵1，劉麗君3，胡凝珠1

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明650118；2. 河北大學生命學院，河北 保定071000；3.昆明醫科大學，昆明650500)

【摘要】目的探討低分子量肝素鈉(low molecular weight heparin sodium，LMWH-Na)佐劑對甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響。方法將ICR小鼠隨機分成8組，6只/組，分別為甲型肝炎減毒活疫苗HepA-l (18 EU)與5種不同劑量(100 μL，20 μL，10 μL，1 μL，0.1 μL)的低分子量肝素鈉混合免疫小鼠作為實驗組，并取生理鹽水作為陰性對照組(Blank)、HepA-l (18 EU)作為陽性對照組、HepA-l混合 Al(OH)3(300 μg)作為鋁佐劑對照組，共免疫一次，于免疫后第 4、8、12、16周進行尾靜脈采血,采用 ELISA 法檢測小鼠血清中抗 HAV 抗原特異性 IgG 抗體水平。在試驗期間，對小鼠的健康狀況進行觀察，并于免疫16周后，取低分子量肝素鈉最大劑量組100 μL組及生理鹽水組小鼠腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、心臟各主要器官制作病理切片進行對比觀察。結果 除陰性對照組外，各組小鼠免疫后第4周后均產生抗-HAV IgG，并隨時間的延長抗體水平逐漸升高，于第 8 周達到最高值，此后逐漸下降。同一時間不同組的抗體水平不同。其中，第4周，第8周，鋁佐劑對照組，低分子量肝素鈉100 μL組，低分子量肝素鈉20 μL組，低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對照組且差異具有統計學意義(P < 0.05)，第12周，鋁佐劑對照組，低分子量肝素鈉20 μL組和低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對照組(P < 0.05)，第16周，鋁佐劑對照組和低分子量肝素鈉10 μL組的抗體水平高于陽性對照組(P < 0.05)，但在整個實驗期間，低分子量肝素鈉各組的抗體水平都低于鋁佐劑對照組的抗體水平。表明低分子量肝素鈉可增強 HAV 抗原特異性體液免疫應答，具有佐劑效應, 最佳劑量為10 μL/組，但其佐劑效應低于鋁佐劑效應。試驗期間，各組小鼠均未出現異常。低分子量肝素鈉100 μL組小鼠腎、脾、肝、肺、心組織均未觀察到病變。結論低分子量肝素鈉可明顯增強 HAV 抗原誘導小鼠的體液免疫應答,具有成為新型疫苗佐劑的研發價值。

【關鍵詞】低分子量肝素鈉；佐劑；甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)；體液免疫

肝素(heparin)是一種由動物結締組織中的肥大細胞合成的黏多糖物質, 是一種天然抗凝血物質。低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是一類平均分子量為5×103的肝素, 臨床應用的低分子量肝素鈉是利用化學或酶解方法由普通肝素制備的鈉鹽[1]。LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na在臨床上的作用主要是抗凝血，近年來，研究發現，LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na除了具有抗凝血作用外，還具有抗病毒，抗炎和抗癌的作用[1]。

LMWH和LMWH-Na的抗病毒作用

近年來研究發現LMWH以及其鈉鹽LMWH-Na對不同的病毒有抑制作用。顧小海等[2]發現，LMWH可以通過感染阻斷途徑和直接殺滅法抑制人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)，與更昔洛韋的抑制病毒增殖機制相互補，從而達到一個更好的治療效果。郭研楠等[3]發現LMWH可以競爭結合呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，阻斷其與腎臟靶細胞結合，有效的抑制RSV對大鼠腎細胞的感染, Frizelle等[4]發現LMWH 可降低柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)感染小鼠后的病死率。另外，LMWH對自然界多種病毒如單純皰疹病毒，人類免疫缺陷病毒及腺相關病毒等都有抑制作用。關于LMWH抗病毒的機制，很多學者也進行了相關報道，主要的一種機制是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)是很多病毒的共同受體，其特有的結構決定了對病毒的特異性。HS是一種高度硫酸化的多糖，參與體內很多生理過程，是糖胺聚糖參與病毒感染的最重要的結構。另外，在生理條件下，HS帶有很多負電荷，可以與正電荷的病毒通過靜電作用結合識別，從而完成病毒與靶細胞的結合，導致病毒感染，而LMWH有著類似HS的結構，并帶有大量的負電荷，可與HS競爭結合病毒，阻斷病毒的感染[2-3]。

LMWH和LMWH-Na抗炎作用

關于LMWH和其鈉鹽LMWH-Na的抗炎作用，目前有兩種不同的理論，一種是LMWH以及LMWH-Na的抗炎作用與其抗凝血作用相關[5]。相關研究表明，LMWH以及它的鈉鹽LMWH-Na的抗炎作用主要是通過與它特異性作用的凝血因子FXa[6]。FXa是一類能促進炎癥反應的酶，其特異性受體是一類G蛋白偶聯受體-效應器蛋白酶受體1(effector protease receptor-1，ERP1)，ERP1存在于多數白細胞中，此類白細胞與FXa結合后，會促進自身分泌IL8,IL6,TNFα，從而激起機體的炎癥反應，而LMWH可通過作用于FXa阻斷其與ERP1的結合，從而發揮抗炎作用。可能通過抗凝血機制達到抗炎結果的有下述兩個實驗，一是韓紅等發現LMWH可以通過抑制細胞因子IL8和TNFα的表達從而抑制三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS)誘發大鼠結腸炎的炎癥現象，減輕腸粘膜的損傷[7]，二是celasco等[8]發現LMWH通過抑制IFNγ的表達水平來抑制由二硝基苯(dinitrobenzene，DNB)誘發的大鼠結腸炎的炎癥反應。凝血反應除FXa途徑引發炎癥外，凝血后體內形成的血栓以及參與凝血過程的其他物質也會引發炎癥，因此，LMWH以及LMWH-Na通過抗凝血作用來消除血栓也可起到抗炎作用[5]。另外，LMWH也可通過非抗凝血機制抗炎癥，例如，LMWH可以通過抑制非抗原誘導的肥大細胞脫顆粒起到抗炎的作用[9]。其機制可能為LMWH和LMWH-Na中的肝素結構作為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3 )受體特異性拮抗劑, 可阻斷IP3 介導的肥大細胞(mast cell，MC)脫顆粒而引起的超敏反應[10]，從而防止多形核白細胞和淋巴細胞移出血管至炎癥處，從而抑制遲發型高敏反應。

LMWH和LMWH-Na的抗癌作用

在抗癌作用方面，LMWH的作用也引起了很多學者的關注，Pross等[11]經研究發現，LMWH能顯著的抑制腹腔內腫瘤的生長和轉移。陳公英等[12]發現LMWH對肝癌有一定的治療作用，其機制是LMWH可以抑制新生血管增生,抑制肝素酶活性以及促進細胞凋亡。

基于以上的這些有關LMWH以及LMWH-Na具有的抗病毒，抗炎以及抗癌等生理作用，我們認為LMWH和它的鈉鹽LMWH-Na有成為佐劑的潛力。

本實驗旨在探討LMWH-Na佐劑對甲型肝炎病毒疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響，以評價其佐劑效果。

1材料和方法

1.1實驗動物

清潔級ICR小鼠共48只，雌性，體重20～25 g，6～8周齡，由中國醫學科學院醫學生物學研究所小動物實驗部提供【SCXK(滇)K2014-0002】。所有的操作均按照醫學生物研究所動物實驗倫理委員會要求進行，實驗在醫學生物學研究所小動物實驗部動物實驗設施內進行【SYXK(滇)K2014-0007】。

1.2主要試劑

甲型肝炎減毒活疫苗 HepA-l(抗原滴度為256 EU/mL)與HAV抗原由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供；低分子量肝素鈉購自昆明積大制藥有限公司；鋁佐劑為Al(OH)3膠體(12.5 mg/mL)，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供；小鼠血清IgG ELISA 試劑盒，購自美國KPL公司。

1.3方法

1.3.1動物免疫

將48只雌性ICR小鼠隨機分成8組，6只/組。將不同劑量(100 μL，20 μL，10 μL，1 μL，0.1 μL)的LMWH-Na與 HepA-l(18 EU)混合，設置為LMWH-Na不同劑量組，并設陰性對照組Blank組、陽性對照組、鋁佐劑對照組，均經皮下注射ICR小鼠，200 μL/只。于免疫后的第4、8、12和 16 周，在小鼠尾靜脈部位采血，分離血清，以備檢測。見(表1)。1.3.2小鼠血清中抗-HAV IgG 抗體水平的檢測

本實驗采用間接 ELISA 法。取HepA-1抗原加入到96孔板中，100 μL/孔，并于濕盒中4℃包被過夜；用BSA 于37℃ 封閉1 h，200 μL/孔；拍凈板子后，加入 倍比稀釋的小鼠血清(起始稀釋倍數為1∶20)，100 μL/孔并于37℃封閉1 h；洗板4次后拍凈板子，加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶400稀釋)，100 μL/孔，于37℃封閉1h；洗板4次，并拍凈板子后加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色10 min；加入2 mol/L H2SO4，100 μL/孔，終止顯色反應，于酶標儀405 nm和605 nm波長處，檢測各孔A值，以陽性反應的最大稀釋度作為樣品的抗體效價，根據ELISA結果計算各組的平均滴度，并以Log10 表示。

1.4統計學分析

應用Graphpad prism 5 軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，以P< 0.05 為差異有統計學意義。

表1　動物分組

注：A-第4周；B-第8周；C-第12周；D-第16周。a-空白組；b-陽性對照組；c-鋁佐劑對照組；d-低分子量肝素鈉100 μL組；e-低分子量肝素鈉20 μL組；f-低分子量肝素鈉10 μL組；g-低分子量肝素鈉1 μL組；h-低分子量肝素鈉0.1 μL組。圖1　不同時間各組小鼠血清抗-HAV IgG 水平Note:A-The 4 week；B-The 8 week；C-The 12 week；D-The 16 week.a-Blank group； b-Postive ncontrol group；c-Aluminium adjuvant control group；d-LMWH-Na 100 μL group；e- LMWH-Na 20 μL group；f- LMWH-Na 10 μL group；g-LMWH-Na 1 μL group； h- LMWH-Na 0.1 μL group.Fig.1　Anti-HAV IgG titers in sera of mice in different groups at 4,8,12 and 16 weeks

2結果

2.1各組小鼠血清中抗-HAV IgG 抗體水平

注：A-陰性對照組心臟；B-陰性對照組肝臟；C-陰性對照組脾臟；D-陰性對照組肺；E-陰性對照組腎；F-LMWH-Na最大劑量組(100 μL)心臟；G- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)肝臟；H- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)脾臟；I-LMWH-Na最大劑量組(100 μL)肺；J- LMWH-Na最大劑量組(100 μL)腎。圖2　陰性對照組和LMWH-Na 最大劑量組(100 μL)組小鼠各臟器組織的病理學觀察(HE染色，×20)Note:A- the heart of negative control; B-the liver of negative control; C-the spleen of negative control; D-the lung of negative control; E-the kidney of negative control; F-the heart of LMWH-Na Maximum dose group; G-the liver of LMWH-Na Maximum dose group; H-the spleen of LMWH-Na Maximum dose group; I-the lung of LMWH-Na Maximum dose group; J-the kidney of LMWH-Na Maximum dose group.Fig.2　Pathological changes in various organs of mice in negative control and LMWH 100 μL group(HE staining,×20)

除陰性對照組外，各組小鼠免疫后第4、8、12、16 周，均產生抗-HAV IgG，并隨時間的延長抗體水平逐漸升高，于第 8 周達到最高值，此后逐漸下降。其中，第4周，第8周，鋁佐劑對照組，LMWH-Na 100 μL組，LMWH-Na 20 μL組，LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對照組且差異具有統計學意義(P<0.05)，LMWH-Na 1μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平也高于抗原對照組，但差異不具有統計學意義(P>0.05)。第12周，鋁佐劑對照組，LMWH-Na 20 μL組和LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對照組(P<0.05)，雖然，LMWH-Na 100 μL組高于陽性對照組，但差異不具有統計學意義(P>0.05),而LMWH-Na 1 μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平低于陽性對照組。第16周，鋁佐劑對照組和LMWH-Na 10 μL組的抗體水平高于陽性對照組(P<0.05)，LMWH-Na 100 μL組，LMWH-Na 20 μL組雖然高于陽性對照組但差異不具有統計學意義(P>0.05)，LMWH 1 μL組和LMWH-Na 0.1 μL組的抗體水平低于陽性對照組。但在整個實驗期間，LMWH-Na各組的抗體水平都低于鋁佐劑對照組組的抗體水平。表明LMWH-Na可增強 HAV 抗原特異性體液免疫應答，具有佐劑效應，最佳劑量為10 μL/組。見圖1。

2.2佐劑病理學分析

實驗期間，低分子量肝素鈉各組及對照組各小鼠情況良好，未出現體重降低，休克，精神不振，掉毛，死亡等現象；觀察病理切片發現低分子量肝素鈉最大劑量組100 μL組和生理鹽水對照組小鼠的腎臟、脾臟、肝臟、肺臟、心臟組織均無異常表現，見圖 2。說明低分子量肝素鈉具有良好的安全性。

3討論

佐劑是一類可以增強疫苗誘導的免疫反應的物質，尋找一種有效的新型疫苗除安全性高外，還應該既能增強疫苗誘導的體液免疫，也能增強疫苗誘導的細胞免疫，并且價格合理。隨著生物技術的發展，現如今新型的疫苗佐劑層出不窮，但目前被認證使用的寥寥無幾，鋁佐劑和流感疫苗佐劑MF59是兩種被批準應用于人類疫苗的佐劑，盡管如此，兩種佐劑仍然有著局限性，作為最廣泛使用的佐劑種類，鋁佐劑在安全性上還是存在著瑕疵，例如在注射部位上易誘發局部的炎癥反應，形成結節等，更為嚴重的鋁佐劑有讓人體發生神經退行性病變的可能[13]，在效用上，鋁佐劑對小分子量抗原免疫應答的增強效果不夠理想[14],除此之外，鋁佐劑和MF59雖然可以有效的增強機體的體液免疫反應，但其在增強機體的細胞免疫方面效果仍然不明顯，因而其作為疫苗佐劑的效用有一定的缺陷，為了彌補現有佐劑的這種缺陷，研究人員做了很多的努力，包括根據toll 樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號途徑的關鍵點作為靶點尋找有效的佐劑并發現了各種TLR激動劑[15]，利用危險模式理論去尋找內源危險信號因子作為佐劑例如硫酸乙酰肝素[13]，還應用復合佐劑去激發體內的體液免疫和細胞免疫，但效果依然不佳，依然不能有效的誘導機體的細胞免疫，因此，尋找一種新型的既能增強體液免疫又能增強細胞免疫的新型疫苗佐劑是目前研發疫苗佐劑的任務。

本實驗將不同劑量的LMWH-Na與HAV疫苗混合免疫小鼠，以用來研究LMWH-Na作為佐劑對誘導小鼠體液免疫的效應，旨在發現一種新型疫苗佐劑，結果表明，LMWH-Na可以有效增強小鼠的體液免疫應答，且安全性良好，具有開發為新型疫苗佐劑的潛力，但其的佐劑效應仍然不如鋁佐劑的佐劑效應。另外，為了找到效果優于鋁佐劑的佐劑，我們實驗室還進行了復合佐劑誘導體液免疫的研究，例如氫氧化鋅與低分子量透明質酸復合佐劑對甲肝乙肝聯合抗原的體液免疫增強作用明顯高于鋁佐劑的佐劑效應[16]，所以我們可以尋找一種可增強細胞免疫的佐劑與另一種可增強體液免疫的佐劑作為復合佐劑，與鋁佐劑的佐劑效應以及安全性進行比較,來尋找比鋁佐劑更易于誘導體液免疫并能誘導細胞免疫的佐劑組合。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]國家科技支撐計劃項目 (2014BAI01B01)；云南省社會發展新藥專項(2013BC011)。

[作者簡介]王瑋(1988-)，女，碩士生，專業：生物化學與分子生物學。 [通訊作者]胡凝珠(1961-)，女，主任技師。E-mail: huningz@126.com。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0019-06

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.004

Effects of low molecular weight heparin sodium adjuvant on humoral immune response induced by Hepatitis A virus vaccine in mice

WANG Wei1，YU Bing-ting2， LI Jian-fang1，LI Yan-han1，LIU Li-jun3，HU Ning-zhu1

(1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118， China；2.Hebeiuniversity，Hebei Baoding 071000，China；3. Kunming Medical University，Kunming 650500，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Low molecular weight heparin sodium (LMWH-Na) adjuvant on humoral immune response induced by hepatitis A virus(HAV)vaccine in mice. MethodsICR mice were randomly divided into 8 groups, six for each, and the mouse of each group are injected respectively with live attenuated hepatitis A vaccine HepA-1(18 EU) +different doses (100 μL, 20 μL, 10 μL, 1 μL, 0.1 μL) of LMWH-Na, while those injected with physiological saline as a negative control group (Blank), those injected with HepA- 1(18 EU) as positive control group, those injected with Al(OH)3(300 μg)+HepA-1(18 EU) as the aluminium adjuvant control group, 200μL for each. The specific IgG level against HAV in sera of mice at weeks 4, 8, 12 and 16 after immunization were determined by indirect ELISA. During the experiment, the health status of the mice were observed, the kidney, spleen, liver, lung and heart of mice immunized with LMWH-Na 100 μL at the maximum dosage and those in negative control group were taken out at week 16 after immunization, and prepared into sections for pathological observation. ResultsIn addition to the negative control group, mice in various group produced anti -HAV IgG at 4 weeks after the immunization, of which the levels increased as time went on, and reached peak values at week 8 then decreased gradually. At 4 week and 8 week, the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group, LMWH-Na 100 μL group, LMWH-Na 20μL group, LMWH-Na 10 μL group were higher than the positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05). At 12 week, the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group, LMWH-Na 20 μL group and LMWH-Na 10 μL group were higher than the positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05). 16 week，the anti -HAV IgG levels of aluminum adjuvant control group and LMWH-Na 10 μL group were higher than positive control group and the difference was statistically significant (P < 0.05)，but the anti-HAV IgG levels of various LMWH-Na groups were lower than the aluminum adjuvant control group. ConclusionsLMWH-Na can obviously enhance the HAV antigen induced humoral immune response in mice,and have a value of becoming a new type of vaccine adjuvant.

【Key words】Low molecular weight heparin sodium(LMWH-Na)；Adjuvant；Hepatitis A virus vaccine；Humoral immunity