溫度、pH值和堿質量分數對牦牛奶曲拉干酪素提取得率和品質的影響

伍七林，唐善虎，李思寧，王 柳，盧付清，白菊紅

（西南民族大學生命科學與技術學院，成都641000）

溫度、pH值和堿質量分數對牦牛奶曲拉干酪素提取得率和品質的影響

伍七林，唐善虎，李思寧，王 柳，盧付清，白菊紅

（西南民族大學生命科學與技術學院，成都641000）

利用高效液相色譜法對牦牛乳干酪素的5-羥甲基糠醛質量濃度進行測定，評定溶解溫度、pH值、堿質量分數對其美拉德反應的影響程度，并篩選出曲拉最佳溶解工藝參數，以提高產品感官品質和提取得率。結果表明，甘孜及周邊地區曲拉理化成分較其他地區有所差別。在25～65℃的溫度范圍內，得率受溫度影響差異顯著，且感官評分與溫度呈負相關，5-HMF質量濃度隨著溫度上升而增加；在7.5～11.5的pH值范圍之內，隨著pH值增加，牦牛曲拉干酪素提取得率和5-HMF質量濃度增加，感官評分降低；在8%～24%的堿質量分數范圍內，隨著堿質量分數的增加，提取得率及5-HMF質量濃度增加，感官評分下降不顯著，綜合各指標，最佳溶解工藝參數為溫度35℃、pH值為10.5和堿質量分數為20%；驗證顯示，該組合得率達到78.67%±0.31%，感官評分為7.9±0.3，5-HMF檢測質量濃度為0.728±0.082 mg/L。該研究建立了一套較優的牦牛曲拉干酪素提取工藝，為曲拉干酪素有效提取及品質檢測提供了新方法。

牦牛干酪素；提取；美拉德反應；5-羥甲基糠醛

0 引言

干酪素的主要成分是酪蛋白，呈白色或微黃色、無臭味的顆粒狀物質，其極高的營養價值以及良好的功能特性被廣泛應用于食品、造紙、制革、涂料、化妝品等行業［1-2］。我國生產工業干酪素的主要原料是“曲拉”［3］。在曲拉制備干酪素的過程中，由于工藝條件的限制，高溫和高pH值環境使獲得的牦牛干酪素外觀呈現出色澤暗黃、變褐，酸度和粘度下降以及氣味不佳等現象，引起產品功能特性、感官品質低下等問題，不能滿足市場對干酪素應用的需求［4］，成為經濟效益和市場競爭的最大阻礙。

本研究針對曲拉制備干酪素過程當中出現的色澤品質和得率低的問題，在加入抗氧化劑的情況下，利用高效液相色譜法測定5-羥甲基糠醛的質量濃度，確定牦牛曲拉干酪素褐變程度。并探討了曲拉溶解因素對干酪素褐變程度、得率及品質的影響，篩選出干酪素提取的最佳溶解工藝參數，對干酪素的生產制備提供理論支撐及參考意義。

1 實驗

1.1 材料與試劑

奶干渣；乙醚，石油醚，硫酸銅，濃硫酸，四硼酸鈉，氫氧化鈉，鹽酸，草酸，三氯乙酸，Na2S2O4（保險粉）以上試劑均為分析純；甲醇（色譜純），5-羥甲基糠醛（標準品）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀；Kjeltec2200自動凱氏定氮儀；MP511 Lab pH Meter；PL303分析天平；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機；DZ350臺式真空包裝機。

1.3 方法

1.3.1 曲拉成分測定

檢測曲拉中水分、蛋白質、灰分、脂肪的質量分數參考國家標準［5-8］。

1.3.2 干酪素提取工藝

1.3.2.1 牦牛曲拉制備干酪素流程

原料檢驗→粉碎→攪拌溶解→過濾→離心脫脂→點酸→洗滌→離心脫水→造?！稍铩b→成品

1.3.2.2 干酪素提取方法

［9］中的方法并加以修改。具體方法如下：①溶解曲拉：稱取定量樣品后加入保險粉（每8 g加入0.15g），料液比為1∶20，升溫至45℃后，緩慢滴加質量分數為16%的NaOH溶液并攪拌，至pH值達到指定值即可。②過濾、離心脫脂：用200目濾布過濾，棄去濾渣，離心處理（4 500 r/min，45℃）。③點酸：緩慢滴加質量分數10%的HCl，調節pH值至4.6左右，緩慢攪拌使酪蛋白完全凝固析出，過濾得酪蛋白凝固物。④清洗、離心脫水：用40℃的溫水，攪拌清洗5 min，重復洗滌3次，在轉速為3 000 r/min下離心脫水30 min。⑤造粒：將酪蛋白凝固物過20目網篩造粒。⑥干燥：將上述干酪素放入40℃鼓風干燥箱干燥30 min，在干燥過程中對其進行翻轉，使其干燥均勻，即得產品。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素試驗設計

（1）溫度對得率及美拉德褐變反應程度的影響。參照1.3.2.2干酪素提取方法，分別控制溶解溫度梯度為25，35，45，55，65℃；研究不同溶解溫度對干酪素得率及其美拉德褐變反應程度的影響。

（2）終點pH值對得率及美拉德褐變反應程度的影響。參照1.3.2.2干酪素提取方法，分別控制最終滴加pH值的梯度為7.5，8.5，9.5，10.5，11.5；研究不同的溶解終點pH值對干酪素得率及其褐變反應程度的影響。

（3）堿濃度對得率及美拉德褐變反應程度的影響。參照1.3.2.2干酪素提取方法，分別控制溶解所添加的NaOH溶液質量分數梯度為8%，12%，16%，20%，24%；研究不同堿液質量分數對干酪素得率和美拉德褐變反應程度的影響。

1.4.2 正交實驗設計

在單因素的試驗基礎上，根據正交試驗設計原理，以溫度、pH值、堿液濃度作為試驗主要因素，試驗的正交因素與水平表見表1。

表1 牦牛曲拉堿溶正交實驗因子與水平

1.5 指標測定

1.5.1 產率

產率=干酪素質量（g）/曲拉質量（g）×100%。

1.5.2 感官鑒定

參照甘伯中［9］干酪素感官評分標準。

1.5.35 -羥甲基糠醛測定

參考文獻［10］中高效液相色譜法測定5-HMF質量濃度的方法，并加以修改。

1.5.3.15 -羥甲基糠醛標準溶液配制

5-羥甲基糠醛儲備液：準確稱取5-羥甲基糠醛2 mg，用蒸餾水定容到10 mL（棕色），配制成質量濃度為200 μg/mL的儲備液。

5-羥甲基糠醛標準溶液：制備質量濃度分別為0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 μg/mL的標準溶液。

1.5.3.2 樣品的預處理

準確稱取2 g固體樣，加入濃度為0.15 mol/L的草酸，充分震蕩后放入沸水浴中加熱25 min，冷卻后加入質量分數為40%三氯乙酸，充分震蕩后，離心并收集上清液，向剩余沉淀中加入10 mL 4%的三氯乙酸，步驟同上，把兩次收集的上清液混合，過0.22 μm濾膜，待測。

1.5.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 um）。流動相：A甲醇、B為水（體積比15∶85），紫外檢測波長為284 nm，進樣量20 uL，柱溫為35℃，流速為0.8 mL/min。

1.6 數據處理

在試驗過程中，每個處理重復3次；對測定數據采用SPSS19.0軟件進行平均數和標準差計算，并對正交試驗結果進行方差分析，不同顯著性的數據以不同的字母或者星號標記。

2 結果分析與討論

2.1 曲拉成分質量分數

本研究曲拉樣品水分、蛋白質、脂肪、灰分質量分數如表2所示。

由表2可以看出，曲拉水分質量分數為11.6%。有相關研究表明西藏地區曲拉水分3%～10%［11］，青海海南地區、黃南地區和果洛地區曲拉水分質量分數分別為14.38%，12.51%和14.38%［12］。各地區曲拉水分質量分數存在差異的主要原因是空氣水分活度不同和曲拉制作工藝上存在差異。在曲拉貯藏過程中，其水分質量分數是影響曲拉質量的重要因素。主要體現在以下兩點：一是水分質量分數過大，曲拉本身發生化學反應，如美拉德反應，脂肪氧化等，在貯藏過程中發生嚴重的褐變、氧化酸敗；二是水分質量分數大，容易感染微生物，微生物污染相應帶來的化學反應導致曲拉的POV值升高、酸度上升，從而影響曲拉質量。

經測定，蛋白質質量分數為67.4%，而根據張洋［11］對曲拉的理化特性研究，西藏多數地區的曲拉中蛋白質質量分數為30%～40%。不同地區的曲拉蛋白質質量分數相差較大，與原料、工藝、當地環境密不可分。經索氏抽提法測定其脂肪質量為4.9%，比西藏地區報道的2.3%～3.2%高出較多，產生的原因是牧民在制作曲拉的過程中工藝不盡相同，在離心方式的選擇上各有差異，是地區與地區脂肪含量不同的重要因素?；一y定灰分的質量分數為5.1%，與其他地區曲拉中灰分含量無明顯差異。

2.2 5-HMF濃度標準曲線

根據以上1.5.3的方法進行色譜測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制5-HMF標準曲線，得到質量濃度與峰面積的線性關系，其線性回歸方程為：y（峰面積）=158.06x-6.6597，相關系數R2=0.9996。

2.3 溫度的影響

溫度對曲拉干酪素提取得率、感官品質以及5-HMF質量濃度的影響如表3所示。

由表3可以看出，溫度在25～65℃范圍內，隨著溶解溫度升高，得率先升高后降低，低于55℃時得率升高，在55℃得率達到最大，為90.60%，各處理組之間差異顯著（P＜0.05），65℃時得率降低，處理組之間差異不顯著（P＞0.05）?？梢婋S著溫度的增加，溶解速率和溶解程度都相應的增加，反之溫度過低，會降低溶解反應速率，這與之前紀銀莉［13］等報道的一致。同時，加熱可以分解蛋白質，產生小分子聚物，增加蛋白質的溶解性，但是加熱時間過長或溫度過高，小分子可溶蛋白聚集成大分子蛋白，從而降低了溶解度［14-16］。

表2 曲拉組分及質量分數%

表3 溶解溫度對得率、感官品質、5-羥甲基糠醛質量濃度的影響

表4 pH值對得率、感官評分、5-羥甲基糠醛質量濃度的影響

隨著溫度的升高感官評分逐漸降低，當溫度超過55℃時，下降程度增大，在65℃時感官評分最低，為4.7，且各處理組感官評分在溫度變化時差異顯著（P＜0.05）。表明溫度是影響干酪素感官品質的重要原因，溫度越高，褐變程度增大，感官評分越低，這與孟岳成［17］等報道的一致。

美拉德反應是羥基化合物（還原糖）和胺基化合物（氨基酸）縮合形成希夫堿，經環化、重排形成Amadori化合物的過程，Amadori化合物由不同的途徑分解，最終生成棕色或黑色的類黑精物質，5-羥甲基糠醛是美拉德反應的中間產物，它的含量可以揭示其褐變程度［17-19］。當溫度在25℃和35℃時，5-羥甲基糠醛質量濃度分別為0.211 mg/L和0.479 mg/L，處理組之間差異不顯著（P＜0.05），可能是由于低溫時美拉德反應程度較低，保險粉對美拉德反應的抑制作用進一步降低產物形成。當溫度在45℃～65℃時，5-羥甲基糠醛質量濃度增幅加大，在65℃時，5-HMF質量濃度值最高達到12.158 mg/L，且處理組之間差異顯著（P＜0.05）。張蘭威［18］等研究發現，溫度升高會促進酪蛋白中的賴氨酸與還原糖發生美拉德反應，使得產品中積累的5-羥甲基糠醛增多?？梢婋S著溫度的增加，5-羥甲基糠醛質量濃度增加，美拉德反應程度增加。

2.4 pH值的影響

pH值對曲拉干酪素提取得率、感官品質以及5-HMF質量濃度的影響如表4所示。

由表4可以看出，當pH值為7.5時，得率最低，為42.36%，在pH值為11.5時，達到最大為84.08%，各處理組在終點pH值升高時得率總體上升（P＜0.05）?？梢婋S著終點pH值升高，曲拉的溶解程度增加，得率升高；同時，終點pH值降低，曲拉溶解不徹底，得率偏低?？梢婋S著pH值升高溶解速率和溶解性都升高。

當pH值為7.5時，感官評分最高為9.6，在pH值為11.5時，感官評分最低為6.3，且各處理組間差異顯著（P＜0.05），可見隨著堿溶pH終點的逐漸增大，感官評分逐漸降低。

表4結果顯示，當pH值升高時，整體上5-HMF含量增加，美拉德反應程度增加。美拉德反應的羰氨縮合是一個可逆的過程，羰基和氨基隨著體系氫離子濃度的變化進行不同程度的離子化，氨基在較低的pH環境中質子化，不能進行親核進攻，只有不帶電的少數能與羰基縮合，酸性環境中羰氨縮合速率很低［20］。可見在堿性環境中，羥氨縮合速率較大。羰氨縮合之后，糖通過反醇醛、烯醇化和脫水反應進行講解，這些反應都是具有堿催化作用的，所以美拉德反應速度和程度隨著pH的升高而增大［21］。當堿溶在pH值為7.5～10.5范圍時，5-HMF質量濃度增加緩慢且5-HMF檢測值較低，差異不顯著（P＞0.05）。導致這一結果的可能原因有二：其一，可能是亞硫酸鹽與羰基化合物發生加成反應，降低了中間產物的活性；其二，可能是保險粉的還原性、亞硫酸鹽的耗氧和降低pH值的作用阻礙了美拉德反應的發生。在pH值為11.5時，5-HMF增加明顯，差異顯著（P＜0.05），原因可能是隨著堿液的加入，保險粉活性降低，美拉德反應程度增加所致。

表5 堿質量分數對提取得率、感官評分、5-羥甲基糠醛質量濃度的影響

表6 不同正交組合處理對提取得率、感官評分、5-HMF質量濃度的影響

2.5 堿質量分數的影響

堿質量分數對曲拉干酪素得率、感官品質以及5-HMF質量濃度的影響如表5所示。

由表5可以看出，隨著堿質量分數的增加，產品的得率整體上逐漸升高，在堿質量分數為24%時，干酪素得率達到最大（73.88%），但是各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。根據Ivan Bonizzi［22］和高蕓芳［23］等人提出酪蛋白由四種單體分別為αs1-酪蛋白、αs2-二酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白組成，這4種單體通過αs-螺旋、β-折疊和β-轉角等結構構成了酪蛋白的空間結構。其中β-折疊結構是酪蛋白二級結構的主要成分，主要存在于蛋白分子疏水區域，隨著堿質量分數的增加，局部堿濃度過大，pH值升高，酪蛋白分子的二級結構發生明顯變化，其β-折疊含量先增后降，疏水作用降低［24］。在蛋白分子通過疏水部分之間的疏水作用自組裝生成膠束時，β折疊結構遭到破壞α-螺旋和轉角的含量增加［25-26］。結果表明：隨著堿濃度的增加，引起局部pH值偏高，產品得率略微增加，同時局部堿濃度過高引起局部蛋白質的結構變化，對蛋白質的內部結構破壞程度也加重。

當堿質量分數為8%時，感官評分最高，為9.6，同時感官品質整體上隨著堿濃度的增加呈下降趨勢，且各處理組之間差異顯著（P＜0.05），當堿濃度為24%時，評分最低，為6.3。原因可能是堿質量分數較低時，局部pH值較低，褐變程度低，在堿質量分數較高時，局部堿質量分數增加，褐變程度高所致。

隨著堿質量分數的增加，5-羥甲基糠醛整體上質量濃度先減后增，堿質量分數8%的5-HMF檢測值較16%的高。原因在于當堿濃度處于較低水平時，加熱時間的延長使美拉德反應產物不斷增加［27-28］。當堿質量分數為12%和16%時，5-羥甲基糠醛質量濃度分別為0.629 mg/L和0.903 mg/L，差異不顯著（P＞0.05），當堿濃度大于16%時，5-HMF含量迅速增加，差異顯著（P＜0.05），可見局部堿濃度升高，pH值增加，美拉德反應程度加深。

2.6 正交實驗結果分析

2.6.1 溶解工藝條件正交優化實驗結果

根據表1設計，以感官評定、5-HMF值為依據，干酪素得率為參考指標，對溶解工藝當中的溫度、pH值以及堿質量分數進行極差和方差分析，結果如表6所示。

由表6可以看出，各因素對得率影響的主次因素是：B＞C＞A，終點pH值是影響得率的主要因素，得率最優組合為A3B3C3。影響感官品質的主次因素：A＞B＞C，溫度和終點pH值是影響感官評分的主要因素，感官品質最優組合為A1B1C2。影響5-HMF質量濃度的主次因素為：B＞A＞C，溫度是影響5-HMF質量濃度的主要因素，5-HMF質量濃度最優組合為A1B1C3。

2.6.2 各因素趨勢

圖2 正交實驗各因素趨勢

圖2為正交實驗各因素趨勢。由圖2可以看出，5-羥甲基糠醛質量濃度和得率整體呈不斷上升趨勢，且5-羥甲基糠醛質量濃度上升幅度較大，產率上升幅度較小，而感官評分呈不斷下降趨勢。在溫度為55℃時，5-羥甲基糠醛和得率達到最大值，分別是12.716 mg/L和81.60%。且溶解溫度各水平對產品的感官品質的影響較大，差異顯著（P＜0.05）。綜上分析，試驗水平選擇溶解溫度為35℃，即A1，與于淼［14］報道的溫度基本一致。

當終點pH值為9.5時，5-羥甲基糠醛質量濃度最低，感官評分最高，而產率最低，分別為0.606 mg/L，7.33，69.27%。當終點pH值為11.5時，5-羥甲基糠醛質量濃度最高，感官評分最低，而得率最高，分別為14.334 mg/L，5.40，89.49%。隨著終點pH值的不斷升高，整體上干酪素得率和5-羥甲基糠醛質量濃度不斷上升，感官評分不斷下降，且溶解終點pH值各水平之間對得率、感官品質的影響較大，差異顯著（P＜0.05），而對5-羥甲基糠醛質量濃度影響無顯著差異（P＞0.05）。綜上分析，在保證得率和感官的情況下，試驗水平應選擇終點pH值為10.5，即B2。與甘伯中［2］報道的pH值基本一致。

隨著堿質量分數的增加，整體上得率先下降后上升、感官評分呈上升趨勢，且5-羥甲基糠醛質量濃度先上升后下降，但各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；當堿濃度為20%時，5-羥甲基糠醛最低為1.516 mg/L，此時感官評分為6.5，得率最大為81.51%，綜合考慮試驗水平應選擇堿濃度為20%。

3 結論

（1）環境、原料以及工藝不同生產的牦牛乳曲拉在水分、蛋白質以及脂肪質量分數不一致；

（2）從曲拉中提取干酪素的得率與溫度、終點pH值以及堿濃度呈正相關。隨著溫度、終點pH值、堿質量分數的增加，產品的得率逐漸升高；感官品質與溫度、pH值以及堿濃度呈負相關，且感官質量與5-HMF質量濃度呈負相關（P＜0.05）。

（3）經過正交實驗對提取工藝優化，確定最佳工藝組合為A1B2C3，即溫度35℃、pH值為10.5和堿質量分數20%；經過3次試驗驗證該組合產率達到75.67%±0.31%，感官品質評分為7.9±0.3，5-HMF質量濃度為0.728±0.082（mg/L）。

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Effect of the temperature，pH value and alkali concentration on the of extraction yield and quality of casein from yak milk Qula

WU Qi-lin，TANG Shan-hu，LI Si-ning，WANG Liu，LU Fu-qing，BAI Ju-hong
（College of Life science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 641000，China）

HPLC was used for the measurement of 5-hydroxymethyl furfural content of yak milk casein to evaluate the extension of Maillard reaction.Solution temperature，pH value，and concentration of alkali were considered for the Maillard reaction，extraction yield and sensory evaluation.To improve the sensory quality of products and the extraction rate，dissolution process parameters were screened and optimized.The results showed that the percentage of moisture，protein，fat，ash in Qula in the area of Ganzi and its surrounding area were different from others.In the range of 25～65℃temperature，the extraction rate increased.At 55℃reached the maximum rate，90.60%. Extraction rate was significantly affected by temperature and sensory evaluation and temperature showed negative correlation，the content of 5-HMF with the temperature rise and increased；at a range of pH value 7.5～11.5，with the increase of pH value，yak milk casein extraction yield and 5-HMF content increasedand sensory score was lower；in the range of 8%～24%alkali concentration，the extraction rate and 5-HMF content increased and sensory score declined，but was not significant.Based on comprehensive consideration，optimal dissolution process parameters for casein extraction were:temperature 35℃，pH10.5 and alkali concentration of 20%；after repeated three times to verify that the combination，the extracted rate reached 78.67±0.31%，sensory score was 7.9±0.3，and 5-HMF content was 0.728± 0.082（mg/L）.The study has established a better yak milk casein extraction method，and provides a new technology for effective extraction of Qula casein and quality detection.

yak casein；extraction；maillard reaction；5-hydroxymethyl furfural

TS252.59

A

1001-2230（2016）08-0021-05

2016-02-29

研究生創新型項目（CX2015SZ094）；國家科技支撐計劃項目（2015BAD29B02）；四川省科技支撐計劃（2014NZ0011）。

伍七林（1991-），男，碩士研究生，從事食品加工與安全方面的研究。

唐善虎