雷公藤內(nèi)酯醇抑制小鼠腎小球系膜細胞表達CXCL10的實驗研究

施棟梁，祝先進，林秋萍，黃麗華，宋艷芳，林青

(1、福建中醫(yī)藥大學，福建　福州350108；2、福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，福建　福州350001；3、福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，福建　福州350004)

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·論著·

雷公藤內(nèi)酯醇抑制小鼠腎小球系膜細胞表達CXCL10的實驗研究

施棟梁1，祝先進2，林秋萍1，黃麗華3，宋艷芳3，林青3

(1、福建中醫(yī)藥大學，福建福州350108；2、福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，福建福州350001；3、福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，福建福州350004)

摘要：目的探討雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TPL）對γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）誘導的小鼠腎小球系膜細胞（SV40MES13）表達趨化因子CXCL10 mRNA的影響及其可能機制。方法將對數(shù)生長期SV40MES13隨機分為空白組、刺激組、干預(yù)組，用不同濃度的IFN-γ（0U/ml～2000U/ml）刺激細胞不同時間（0h～48h）后，觀察細胞表達CXCL10 mRNA的變化；用CCK-8法檢測不同濃度（2ng/ml～20ng/ml）TPL對SV40MES13生存率的影響，選用細胞生存率大于90%的TPL用于后續(xù)實驗，觀察TPL對SV40MES13表達CXCL10 mRNA的影響；選用JAK/STAT信號通路特異性抑制劑AG490干預(yù)細胞，探討IFN-γ是否通過JAK/STAT信號通路誘導CXCL10表達；收集以上細胞，用Real-Time PCR技術(shù)檢測各組CXCL10 mRNA表達水平。結(jié)果IFN-γ能誘導SV40MES13表達CXCL10 mRNA，并呈時間、劑量依賴性；AG490具有抑制IFN-γ誘導的SV40MES13表達CXCL10 mRNA；TPL具有抑制IFN-γ誘導的SV40MES13表達CXCL10 mRNA的作用。結(jié)論IFN-γ可能通過激活JAK/STAT信號通路，誘導SV40MES13表達CXCL10 mRNA；TPL具有抑制IFN-γ誘導的SV40MES13表達CXCL10的作用。

關(guān)鍵詞：雷公藤內(nèi)酯醇；IFN-γ；腎小球系膜細胞；CXCL10；JAK/STAT

狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）合并雙腎不同程度免疫性損害，同時具有明顯腎功能損傷的一種自身免疫性疾病[1]。在腎組織活檢中幾乎所有SLE患者都有不同程度的腎臟受累，其中約有60%的SLE患者可發(fā)展為LN，約有5%～20%的LN患者在10年內(nèi)可發(fā)展為終末期腎臟病，最終導致患者死亡[2]。

趨化因子作為介導炎癥與免疫反應(yīng)的橋梁，參與了多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3]。CXC趨化因子配體10（Chemokine (C-X-C motif) ligand 10，CXCL10），又稱為γ干擾素誘導蛋白10（interferon-γ-inducible protein 10，IP-10)，是高效的淋巴細胞趨化劑，具有激活和趨化CD4+T細胞，促進T細胞遷移至炎癥組織中的作用[4]。既往的研究表明CXCL10在LN患者的腎組織、血清、尿液中異常表達，參與了LN的發(fā)生發(fā)展[5]。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TPL）是雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種藥理作用，在臨床上廣泛用于炎癥性疾病和自身免疫性疾病的治療中[6]。本課題以小鼠腎小球系膜細胞（SV40MES13）為研究對象，探討IFN-γ是否能誘導SV40MES13表達趨化因子CXCL10，并應(yīng)用JAK/STAT信號通路特異性抑制劑AG490、TPL對SV40MES13進行干預(yù)，了解AG490、TPL對CXCL10表達的影響，初步探討IFN-γ、TPL調(diào)控SV40MES13表達CXCL10的機制。

1　材料與方法

1.1材料小鼠腎小球系膜細胞（SV40MES13）購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自杭州四季青公司；EMEM-F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS購自美國HyClone公司；雷公藤內(nèi)酯醇由福建醫(yī)科大學藥學院林友文教授贈予，純度大于99.48%；二甲基亞砜購自美國Sigma公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；重組小鼠IFN-γ、AG490購自美國R＆D公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量檢測試劑盒購自美國Promega公司；趨化因子CXCL10、GAPDH上下游引物均由上海英濰捷基公司提供。

1.2細胞培養(yǎng)SV40MES13培養(yǎng)在含有5%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。種6孔板時，調(diào)整細胞濃度為1.0×105/ ml用于實驗，種96孔板時，調(diào)整細胞濃度為4.0× 104/ml用于實驗。待細胞生長至70%～80%融合時，更換無胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基饑餓處理12h后用于后續(xù)實驗。

1.3IFN-γ誘導實驗SV40MES13饑餓處理后，分別加入不同濃度IFN-γ（0U/ml、100U/ml、500U/ml、750U/ml、1000U/ml、1500U/ml、2000U/ml）于DMEM -F12培養(yǎng)基中，刺激24h后收集細胞備用；SV40MES13饑餓處理后，加入最適濃度的IFN-γ于DMEM-12培養(yǎng)液中，分別刺激不同時間（0h、6h、12h、24h、48h）后，收集細胞備用。

1.4AG490干預(yù)實驗將饑餓處理后的SV40MES 13隨機分成3組：空白組（不添加任何刺激）、刺激組（1000U/ml的IFN-γ刺激）、干預(yù)組（20μmol/ml 的AG490干預(yù)細胞2h后加入1000U/ml的IFN-γ共培養(yǎng)），24h后收集細胞備用。

1.5雷公藤內(nèi)酯醇干預(yù)實驗SV40MES13饑餓處理后，用不同濃度TPL（2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml、15ng/ml、20ng/ml）與SV40MES 13共培養(yǎng)24h后加入10μl CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑，孵育1h后用酶標儀測出OD值，計算不同濃度TPL對于SV40MES13生存率的影響，選用適宜濃度的TPL用于后續(xù)實驗；將饑餓處理后的SV40MES13隨機分成3組：空白組（不添加任何刺激）、刺激組（1000U/ml的IFN-γ刺激）、干預(yù)組(不同濃度的TPL干預(yù)細胞2h后加入1000U/ml 的IFN-γ共培養(yǎng)），24h后收集細胞備用。

1.6Real-Time PCR檢測CXCL10 mRNA的表達收集以上細胞，用RNA提取試劑盒提取細胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR實驗。反應(yīng)條件為：95℃2min，1個循環(huán)；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參照校正，用2-△△Ct計算每個樣本mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1　Real-Time PCR引物序列

1.7統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間均數(shù)的比較用t檢驗，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度IFN-γ對SV40MES13表達CXCL10 mRNA的影響應(yīng)用不同濃度IFN -γ刺激SV40MES13后發(fā)現(xiàn)，低濃度IFN-γ即可誘導SV40MES13表達CXCL10 mRNA，隨著IFN-γ濃度的不斷增加，CXCL10 mRNA表達量也不斷增加。當IFN-γ濃度為1000U/ml時，CXCL10 mRNA表達量是空白組的72.35倍（F=96.78，P＜0.01），此后，隨著IFN-γ濃度的增加，CXCL10 mRNA表達進入平臺期（圖1）。

2.2IFN-γ作用不同時間對SV40MES13表達CXCL10 mRNA的影響應(yīng)用1000U/ml的IFN-γ刺激SV40MES13不同時間后發(fā)現(xiàn)，6h時CXCL10 mRNA的表達水平即開始升高，24h時CXCL10 mRNA表達量是空白組的58.91倍（F=111.25，P＜0.01)，并達到最高峰，在48h時CXCL10 mRNA表達下降（圖2）。

圖1　不同濃度IFN-γ對CXCL10 mRNA表達的影響

圖2　1000U/ml IFN-γ作用不同時間對CXCL10 mRNA表達的影響

2.3AG490對IFN-γ誘導的SV40MES13表達CXCL10 mRNA的影響應(yīng)用JAK/STAT信號通路特異性抑制劑AG490干預(yù)SV40MES13后發(fā)現(xiàn)，AG490具有抑制IFN-γ誘導的CXCL10 mRNA表達的作用，與刺激組相比，抑制率為78.40%，差異具有統(tǒng)計學意義（tCXCl10=5.39，P＜0.01），見圖3。

2.4雷公藤內(nèi)酯醇對SV40MES13生存率的影響用不同濃度的TPL與SV40MES13共培養(yǎng)24h，我們選用細胞生存率大于90%時的TPL濃度（2ng/ ml、4 ng/ml、8ng/ml）用于后續(xù)試驗中（表2）。

表2　TPL對SV40MES13細胞生存率的影響

2.5雷公藤內(nèi)酯醇對IFN-γ誘導的SV40MES13表達CXCL10 mRNA的影響應(yīng)用不同濃度TPL干預(yù)SV40MES13后發(fā)現(xiàn)，TPL具有抑制IFN-γ誘導的CXCL10 mRNA表達的作用，且抑制效果呈劑量依賴性。與刺激組相比，2ng/ml的TPL就能抑制CXCL10 mRNA的表達，抑制率為45.4%（F= 64.72，P＜0.01）；4ng/ml的TPL對CXCL10 mRNA的抑制率為65.4%（F=64.72，P＜0.01）；8ng/ml的TPL對CXCL10 mRNA的抑制率為89.76%（F= 64.72，P＜0.01），見圖4。

圖3　AG490及TPL對CXCL10 mRNA表達的影響

圖4　不同濃度TPL對CXCL10 mRNA表達的影響

3　討論

CXCL10屬于CXC類趨化因子，是高效的淋巴細胞趨化劑，具有激活與趨化CD4+T淋巴細胞、NK細胞等作用[7]。研究表明，LN患者腎組織、血清、尿液中可見大量的CXCL10表達[5]；通過基因芯片分析MRL/lpr狼瘡腎炎小鼠可見CXCL10表達上調(diào)[8]；前期研究也發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞在受到IFN-γ的刺激后，CXCL10 mRNA及蛋白表達明顯增加[9]；同時有學者稱CXCL10在LN的輔助性診斷中具有100%的敏感性以及98%的特異性，可作為LN輔助性診斷的實驗室指標[10，11]，可見CXCL10 在LN發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

LN基本的病理損害為腎小球系膜細胞不同程度的增生，T淋巴細胞、單核細胞的浸潤與核碎裂，腎小管間質(zhì)纖維化以及腎小球血管病變[12，13]。在LN患者腎組織活檢中發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細胞增生，大量的免疫復合物沉積于腎小球系膜區(qū)，在電鏡下腎小球系膜區(qū)內(nèi)存在數(shù)量不等的電子致密物沉積，可見腎小球系膜細胞在LN形成中具有重要作用[14]。

研究表明Th1細胞過度活化導致的T細胞亢進是LN發(fā)病中重要的環(huán)節(jié)。在Th1型淋巴細胞為主的慢性炎癥性疾病中，IFN-γ是最有效的促炎因子[15]，因此本實驗以腎小球系膜細胞為研究對象，以IFN-γ為誘導劑，探討IFN-γ是否能誘導SV40MES13表達CXCL10。應(yīng)用不同濃度的IFN-γ刺激細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，IFN -γ能誘導SV40MES13表達CXCL10 mRNA，并呈時間、劑量依賴性。當IFN-γ的濃度為1000U/ml，CXCL10 mRNA相對表達量是空白組的72.35倍（P＜0.01），之后隨著IFN-γ濃度的增加，CXCL10 mRNA表達進入平臺期。因此我們推測，在LN中腎小球系膜細胞受到IFN-γ等前炎癥因子刺激后表達大量的CXCL10，CXCL10通過與免疫細胞表面的CXCR3受體結(jié)合后，激活與趨化CD4+T細胞、巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞遷移至腎組織中，從而參與炎癥反應(yīng)，促進了腎損害以及腎小球的硬化，最終誘發(fā)狼瘡腎炎。

JAK/STAT信號通路是一條由多種細胞因子共同作用的信號轉(zhuǎn)導途徑，IFN-γ是此信號通路重要的激活劑[16]。為了驗證IFN-γ誘導SV40MES13表達CXCL10與JAK/STAT信號通路之間的關(guān)系，本實驗選用JAK/STAT信號通路特異性抑制劑AG490預(yù)處理SV40MES13，之后加入IFN-γ共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，AG490能明顯抑制CXCL10 mRNA的表達，與刺激組相比AG490對CXCL10 mRNA的抑制率為78.4%（P＜0.01）?？梢姡琁FN-γ可能通過激活JAK/STAT信號通路誘導細胞表達CXCL10，通過阻斷JAK/STAT信號通路對減少CXCL10的表達、減少淋巴細胞的浸潤、減輕或阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)生對LN的治療具有重要意義。

TPL具有抗炎、免疫抑制等藥理作用，在臨床上應(yīng)用于各種腎臟疾病的輔助治療中。我們通過CCK-8法檢測不同濃度TPL對SV40MES13的細胞毒性，選用細胞毒性小TPL用于后續(xù)試驗；為了探討TPL是否能抑制IFN-γ誘導的CXCL10 mRNA的表達，本實驗采用不同濃度TPL對細胞表達CXCL10進行干預(yù)。結(jié)果顯示，TPL能明顯抑制IFN-γ誘導的CXCL10 mRNA表達，與刺激組相比2ng/ml TPL對CXCL10 mRNA抑制率為45.4%（P＜0.01），4ng/ml的TPL對CXCL10 mRNA的抑制率為65.4%（P＜0.01）；8ng/ml的TPL對CXCL10 mRNA的抑制率為89.76%（P＜0.01）。由此可見，TPL 對IFN-γ誘導的CXCL10 mRNA表達具有明顯抑制作用。

綜上所述，IFN -γ能夠誘導體外培養(yǎng)的SV40MES13表達CXCL10 mRNA，其誘導機制可能與JAK/STAT信號通路的活化有關(guān)。TPL對 IFN-γ誘導的CXCL10的表達具有抑制作用，有關(guān)TPL調(diào)控CXCL10表達的機制與JAK/STAT信號通路是否存在一定聯(lián)系值得我們進一步去研究。

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中圖分類號：R-332，R593.24+2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0267-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.003

基金項目：福建省自然科學基金(2013J01323)

作者簡介：施棟梁，男，1990年8月生，碩士研究生，臨床檢驗診斷學，主要從事免疫實驗與臨床相關(guān)研究

通信作者：林青，女，1969年4月生，碩士，主任技師，臨床檢驗診斷學，主要從事免疫疾病的臨床檢驗與研究工作，E-mail：fjlinqing@126.com

(收稿日期2016-03-24；修回日期2016-04-20)

Inhibitory effects of triptolide on the expression of CXCL10 in mice glomerular mesangial cells

SHI Dongliang，ZHU Xian-jin，LIN Qing，et al. Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China.

Abstract：Objective To investigate the effects of triptolide（TPL）on the expression of CXCL10 mRNA induced by interferon gamma(IFN-γ) in mouse glomerular mesangial cells(SV40MES13) and its mechanism. Methods SV40MES13 were randomly divided into blank group，stimulation group，intervention group. Different concentrations of IFN-γ(0U/ml～2000U/ml) were used to stimulate the cells with different time(0h～48h)，and then observe the changes of the expression of CXCL10 mRNA；CCK8 assay was used to detect the effects of different concentrations of TPL(2ng/ml～20ng/ml) on the survival rate of SV40MES13. The appropriate concentration of TPL causing cell survival rate >85% was applied to subsequent experiment，and then observe the effect of TPL on the expression of CXCL10 mRNA；JAK/STAT signaling pathway specific inhibitor AG490 was used to intervene in cells to investigate whether IFN-γ induced the expression of CXCL10 through the JAK/STAT signaling pathway. Real-Time PCR was used to detect the expression level of mRNA CXCL10. Results The present study showed that IFN-γ induced the expression of CXCL10 mRNA in SV40MES13 through a dose- and time-dependent manner；The JAK/STAT signaling pathway specific inhibitor AG490 inhibit the expression of CXCL10 mRNA induced by IFN-γin SV40MES13；TPL could inhibit the expression of CXCL10 mRNA induced by IFN-γ in SV40MES13 as well. Conclusion IFN -γ could induce expression of CXCL10 by activating JAK/STAT signaling pathway in SV40MES13；TPL could inhibit expression of CXCL10 by blocking JAK/STAT signaling pathway in SV40MES13.

Key words:Triptolide；IFN-γ；Glomerular Mesangial Cell；CXCL10；JAK/STAT