膽紅素對HBV DNA定量檢測結果的影響

崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(鹽城市第一人民醫院檢驗科，江蘇　鹽城224001)

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·綜述·

膽紅素對HBV DNA定量檢測結果的影響

崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(鹽城市第一人民醫院檢驗科，江蘇鹽城224001)

摘要：目的探討高膽紅素血清對實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的影響，并選擇有效減低膽紅素對HBV DNA測定干擾的方法。方法將不同濃度的HBV DNA標準品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3. 0×104IU/ml）按相同比例分別添加到膽紅素正常血清和高膽紅素血清中，按不同濃度膽紅素進行分組來考察不同濃度膽紅素血癥對HBV DNA測定結果的影響程度大小，然后再分別測定HBV DNA的結果，每個標本重復檢測三次，同時觀察擴增曲線是否存在差異。對影響測定的血清標本作10、100、1000倍稀釋后，進行檢測，并收集5例臨床高膽紅素的乙肝血清標本進行驗證。結果血清膽紅素濃度介于401~500μmol/L、501~600μmol/L、>600μmol/L三個組，HBV DNA定量檢測結果高于膽紅素正常血清組，差異有統計學意義（P＜0.05），血清膽紅素濃度濃度介于20.6~100μmol/L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol/L四個組，與膽紅素正常血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；血清膽紅素濃度高于400μmol/L血清擴增時，擴增曲線先緩慢升高，其基線高于標準品，其閾值線處于拐點之下非S擴增區，之后升高呈現S型曲線；10、100、1000倍稀釋后，擴增曲線平行且等間距，結果一致性較好。5例高膽紅素血清有4例在定閾值線時，其閾值線處于拐點之下非S擴增區，定值偏高，結果高于稀釋后的標本，差異有統計學意義(P＜0.05)；有1例閾值線處于拐點處，其斜率低于標準品，結果低于稀釋后的標本，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論總膽紅素高于400μmol/L對熒光定量PCR檢測HBV DNA結果存在影響，通過稀釋一般就可以降低膽紅素因素干擾。

關鍵詞：實時熒光定量PCR；HBV DNA；膽紅素

我國目前有慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者9400萬，其中慢性乙型肝炎患者2000萬～4000萬[1]。血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）水平是目前臨床上評價HBV復制情況的“金標準”，且對非活動性HBsAg攜帶狀態的判定有重要意義。目前HBV DNA的測定方法大多采用基于Taqman探針技術的實時熒光定量聚合酶鏈反應(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)，該方法具有實時監測，操作簡單，定量范圍寬，結果重復性好等優點[2-4]。影響PCR測定重復性和準確性的因素，除了PCR本身因素外，標本狀態直接影響檢驗結果的準確性[5-7]，多數學者認為黃疸對HBV DNA定量檢測無明顯影響[8，9]，而本人在日常工作中發現膽紅素濃度過高會導致血清HBV DNA測定結果偏高或偏低，導致結果不準確。本文就不同膽紅素水平對HBV DNA定量檢測的影響及如何去除膽紅素因素干擾作一些探討。

1　材料與方法

1.1標本來源分別收集乙肝兩對半全陰性、HBV DNA陰性、膽紅素正常的混合血清(膽紅素正常血清)和乙肝兩對半全陰性、HBV DNA陰性、高膽紅素的混合血清(高膽紅素血清)，收集2013年1月至5月門診及住院乙肝患者的高膽紅素血清5例，其中男患者4例，年齡介于31~62歲之間，女患者1例，年齡61歲。

1.2試劑與儀器HBV DNA定量檢測試劑購自上海復興醫學科技有限公司，儀器為羅氏公司Lightcycler 480Ⅱ。膽紅素檢測試劑購自寧波美康，儀器為日本Olympus AU5400全自動生化分析儀。

1.3檢測方法⑴將不同濃度的HBV DNA標準品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml）按相同比例分別添加到膽紅素正常血清和高膽紅素血清中，按不同濃度膽紅素進行分組來考察不同濃度膽紅素血癥對HBV DNA測定結果的影響程度大小，每個標本重復檢測三次，同時觀察擴增曲線是否存在差異。⑵將擴增曲線異常的高膽紅素血清用膽紅素正常血清進行稀釋，加入HBV DNA標準品，再分別測定HBV DNA的結果，確定多少濃度以下的膽紅素對HBV DNA檢測不產生影響。⑶將高膽紅素血清作10、100、1000倍稀釋，進行檢測。⑷將臨床收集的5例高膽紅素的乙肝血清標本進行HBV DNA檢測，并作稀釋后檢測。⑸熒光定量PCR法檢測HBV DNA含量，化學氧化反應檢測血清總膽紅素。

1.4統計學分析實驗數據均通過SPSS 18.0軟件進行處理，計量數據采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度水平總膽紅素血清HBV DNA檢測結果血清膽紅素濃度介于401~500μmol/L、501~ 600μmol/L、>600μmol/L三個組，HBV DNA定量檢測結果高于膽紅素正常血清組，差異有統計學意義（P＜0.05），血清膽紅素濃度濃度介于20.6~100μmol/ L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol /L四個組，與膽紅素正常血清組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。血清膽紅素濃度高于400μmol/L血清擴增時，擴增曲線先緩慢升高，其基線高于標準品，其閾值線處于拐點之下非S擴增區，定值偏高；之后升高呈現S型曲線，但其斜率低于標準品，見圖1。

表1　不同水平總膽紅素血清HBV DNA測定結果比較(logC±s)

圖1　高膽紅素血清擴增曲線

2.2對高膽紅素血清進行倍比稀釋后的結果將高膽紅素患者血清作原倍及10、100、1000倍稀釋后測定HBV DNA含量，結果10倍稀釋后擴增曲線斜率即接近標準品的擴增曲線，10、100、1000倍稀釋后擴增曲線平行且等間距，結果一致性較好，見圖2。

圖2　高膽紅素血清原倍、10、100、1000倍稀釋后擴增曲線

2.3臨床標本檢測結果5例高膽紅素血清有4例在定閾值線時，其閾值線處于拐點之下非S擴增區，定值偏高，結果高于稀釋后的標本，差異有統計學意義(P＜0.05)；有1例閾值線處于拐點處，其斜率低于標準品，結果低于稀釋后的標本，差異有統計學意義(P＜0.05). 5例高膽紅素血清用正常血清作10倍和2倍稀釋制備總膽紅素含量介于3.4~ 100μmol/L、101 ~400μmol/L，對兩組血清HBV DNA結果進行比較，差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表2。

表2　臨床高膽紅素血清標本HBV DNA測定結果比較

3　討論

對實時熒光定量PCR準確性造成影響的因素很多，任何能影響PCR擴增的因素均可影響其擴增的效率及定量的準確度。除了PCR本身因素及反應體系外，樣本狀態亦可能對檢測產生影響，臨床上經常會遇到溶血、黃疸和脂血等血清樣本，本研究為著重了解膽紅素對HBV DNA檢測的影響，故在收集試驗樣本時已對溶血、脂血樣本進行排除篩選。

正常人血清總膽紅素水平在3.4-20.5μmol/L之間，高膽紅素血癥在臨床較為常見，如急慢性肝性疾病、新生兒黃疸等患者，其血清中總膽紅素濃度常明顯升高，高膽紅素血影響許多臨床檢測結果的準確性。本研究發現總膽紅素高于400μmol/ L，將影響熒光定量PCR法檢測HBV DNA含量，對擴增有干擾，影響結果的定值。高膽紅素血清擴增時，擴增曲線先緩慢升高，其基線高于標準品，之后升高呈現S型曲線，但其斜率低于標準品，如閾值線處于緩慢升高期，定值不準確，如閾值線抬高至S型曲線拐點處，其斜率低于標準品曲線，這樣將導致定值結果偏低。而多數學者認為，黃疸對于HBV DNA檢測無影響。這可能與使用不同廠家生產的試劑盒對核酸檢測靈敏度不一樣、對黃疸標本中的膽紅素處理能力不一樣有關。

在檢測中應盡可能消除膽紅素的干擾作用，目前可用化學方法氧化分解膽紅素后再進行測定，另外還可以用特異性膽紅素吸附劑吸附膽紅素來減少對測定結果的影響，但尚未用于臨床檢測[10-15]。本文對于高膽紅素血清采用陰性稀釋后再檢測HBV DNA含量發現，膽紅素對于HBV DNA檢測的干擾已大大減低，其擴增曲線斜率已與標準品曲線一致。10、100、1000倍稀釋后擴增曲線平行且等間距，結果一致性較好，因此，在重度黃疸血清測定HBV DNA時，如僅采用2倍稀釋，可能膽紅素濃度仍會過高，影響測定；采用10倍稀釋即可將膽紅素濃度降至100μmol/L以下，降低了對擴增的干擾。

通過不同水平膽紅素對熒光定量PCR測定HBV DNA的探討，建議臨床各實驗室進行試劑性能評價時，設立適合本實驗室的膽紅素評價試驗，制定適合本實驗室的標本檢測程序。

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·論著·

中圖分類號：R446.11+2，R512.6+2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0283-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.008

基金項目：鹽城市科技立項課題，編號YK2015002

作者簡介：崔蕾蕾，女，1980年9月生，碩士，副主任檢驗技師，主要研究方向為免疫學和分子生物學。

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-23)

Effect of bilirubin on the detection of HBV DNA

CUI Leilei，SHAO Keke，Zuo Yueyuan. Department of Laboratory Medicine，the First People’s Hospital of Yancheng City，Jiangsu Yancheng 224000，China.

Abstract：Objective To investigate the effect of high level of serum bilirubin on detection of hepatitis B virus DNA (HBVDNA) by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)，and select the effective method to reduce the interference of bilirubin on HBV-DNA detection. Methods The different concentrations of HBV-DNA standard products (S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml) were added into the serums which contained normal and high concentration of bilirubin，according to the same proportion. The effect of different concentrations of bilirubin on the determination results of HBV-DNA were investigated. Then the detection of HBV-DNA in each serum sample were performed in triplicate，and the difference of the amplification curves was observed. The serum samples diluted by 10，100 and 1000 times were tested，respectively. The serum samples from 5 cases of clinical high bilirubin were collected and used to result validation. Results The level of HBV-DNA in the serums contained bilirubin with the concentrations in 401-500μmol/L，501-600μmol/L，>600μmol/L were significantly higher than that in normal bilirubin group (P<0.05)；compared with normal bilirubin group，there is no siginificant differrence in the level detected of HBV-DNA in serum contained bilirubin with the concentrations in 20.6-100μmol/L，101-200μmol/L，201-300μmol/L and 301-400μmol/L. When the concentration of bilirubin is higher than 400μmol/L，the amplification curve raised slowly at first，and the baseline was higher than the standard. The threshold line was under the inflection point. Subsequently the amplification curve raised as S curve；for the serum samples diluted by 10，100 and 1000 times，the amplification curve was parallel and equal spaced，and the results were consistent. Among 5 clinical cases detected，4 cases presented the threshold line under the inflection point in the non-amplification region of S curve，and the detection results were significantly higher than the samples diluted (P<0. 05)；1 case presented the threshold line through the inflection point in amplification curve，the slope of which was lower than the standard curve，and the detection result was significantly lower than the sample diluted (P<0.05). Conclusion The high level of serum total bilirubin (>400μmol/L) could interfere detection of HBV DNA in fluorescence quantitative PCR，and the interference effect of bilirubin could be reduced by dilution.

Key words：Fluorescence quantitative PCR；HBV-DNA；Bilirubin