PLT- F計數低值血小板的準確性評價

陳娟，董晶，彭賽輝，吳志成

(北京大學深圳醫院檢驗科，廣東　深圳518036)

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·綜述·

PLT- F計數低值血小板的準確性評價

陳娟，董晶，彭賽輝，吳志成

(北京大學深圳醫院檢驗科，廣東深圳518036)

摘要：目的探討Sysmex XN-9000全自動血細胞分析儀PLT-F通道在低值血小板測定中的臨床意義。方法采用Sysmex XN-9000全自動血細胞分析儀的3種方法電阻抗法（PLT-I）、光學法（PLT-O）、熒光核酸染色法（PLT-F）進行血小板計數，從精密度、低值血小板及紅細胞碎片干擾評價，并與使用抗CD61抗體的流式細胞術檢測結果進行比較。結果與電阻抗法（PLT-I）、光學法（PLT-O）相比，熒光核酸染色法（PLT-F）的重復性最好，精確度較高；在紅細胞碎片干擾實驗中，PLT-F具有較強的抗干擾能力（高、低濃度組P>0.05），PLT-O次之（高濃度組P<0.01，低濃度組P>0.05）；低值血小板相關分析結果顯示3種方法都得到良好的相關性，PLT-F法的準確性較高，尤其在低值血小板計數中。結論臨床常規標本可以使用Sysmex XN-9000全自動血液分析儀的PLT-I法檢測，當標本血小板數目異?；蛉苎獣r，建議使用PLT-O法或PLT-F法復查，必要時采用鏡檢法或流式細胞術。

關鍵詞：血小板計數；熒光核酸染色法；流式細胞術；低值血小板

血小板（platelet，PLT)是由骨髓造血組織中的巨核細胞產生，呈兩面微凸的圓盤狀或橢圓形小體，直徑只有1.5～3μm，具有維持血管內皮完整性以及黏附、聚集、釋放、促凝和血塊收縮等功能，而血小板計數(platelet count)是測定單位容積的血液中血小板的數量[1]。臨床上血小板計數常使用血液分析儀、顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，但血小板由于體積小，容易發生黏附、聚集和變性破壞，而且不易與其它非血小板小顆粒區別，所以手工計數方法常難以準確計數。在日常檢測工作中主要使用血液分析儀進行血小板計數，常利用電阻抗法對血小板進行定量檢測，其優點是重復性好、檢測速度快、成本低，但易受小紅細胞、碎片紅細胞、大血小板等影響，使結果偏高或偏低，所以當儀器檢測報告顯示血小板數量、圖形異?；驁缶崾緯r，應使用顯微鏡或流式細胞儀法對血小板計數結果進行復核[2]，而國際血液學標準化委員會（ICSH）推薦的參考方法是應用流式細胞術檢測血小板計數[3]。為評價臨床血小板計數準確性，我們使用SYSMEX XN全自動血細胞分析儀的電阻抗法（PLT-I)、光學法（PLT-O）、熒光核酸染色法（PLTF)分別對正常對照組、大血小板組、小紅細胞干擾組以及紅細胞碎片干擾組的臨床標本進行計數，并以流式細胞儀為參考標準，對檢測結果進行統計學處理。

1　材料與方法

1.1標本來源收集北京大學深圳醫院2015年1月至3月血小板計數≤50×109/L的EDTA抗凝全血標本26例，其中男性11例，女性14例，平均年齡36.3±22.5歲，顯微鏡下觀察無血小板聚集，無碎片紅細胞增多（<1.0%)。正常對照組按照中華人民共和國衛生行業標準WS/T405-2012《血細胞參考區間》參考個體選擇，兩組年齡和性別差異無統計學意義。

1.2儀器與試劑儀器為日本SysmexXN-9000全自動血液分析儀。美國貝克曼Navios AV40310流式細胞儀。美國Beckman-Coulter公司Z2細胞計數儀(簡稱Z2)。SysmexXN-9000儀器使用的質控品、試劑均為日本Sysmex公司生產的原裝配套試劑。美國Beckman-Coulter公司生產的抗CD61單抗（Phycoerythrin PE)。

1.3檢測方法

1.3.1收集全血標本分別在XN-9000血液分析儀上CDC檢測通道/WPC檢測通道檢測血小板，同時在美國Beckman-Coulter公司Z2細胞計數儀計數RBC數，貝克曼Navios流式細胞儀檢測血小板表面糖蛋白CD61。

1.3.2PLT計數用ICSH推薦的PLT/RBC比值法[3]作為血小板計數的參考方法。取混勻的新鮮血5μl，加熒光素標記物抗CD61單抗5μl，混勻并靜置15min，再加人4.99mlPBS(pH7.2的磷酸鹽緩沖液)，混勻，以貝克曼Navios流式細胞儀檢測RBC/ PLT比率，將結果乘以Z2檢測所得RBC數，即得PLT數。

1.4統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件及Microsoft Office Excel2007進行數據處理分析。

2　結果

2.1低值血小板批內精密度檢測用XN-9000血液分析儀PLT-I，PLT-O，PLT-F通道分別檢測3例低值血小板及正常血小板3例，按常規檢測方法分別各檢測11次，計數后10次檢測結果平均值、標準差及變異系數。見表1。

表1　血小板批內精密度比較(×109/L n=10)

從表1可以看出PLT-I通道平均變異系數為5.32%，PLT-O通道平均變異系數為4.04%，PLT-F通道平均變異系數為2.61%，其中低值血小板的變異系數分別為：8.58%（PLT-I），5.79%（PLT-O），4.08%(PLT-F)。

2.2低值血小板檢測收集血小板計數（PLT-F)≤50×109/L的EDTA抗凝全血標本26例，分別用PLT-I、PLT-0、PLT-F方法對其血小板測定，采用FCM PLT/RBC比值法檢測結果作為參照，與上述三種方法進行比較，見圖1~圖3。

圖1　PLT-I與流式細胞術比較

圖2　PLT-0與流式細胞術比較

圖3　PLT-F與流式細胞術比較

2.3碎片紅細胞干擾試驗[4，5]取1份正常人EDTA抗凝血樣分裝4管(每管800μl)，將第1管3600r/ min離心5min后，取壓積紅細胞層100μl，加入蒸餾水振蕩搖勻后，3600r/min離心5min，留取底層紅細胞碎片，用生理鹽水洗滌3次后稀釋至200μl，取上述紅細胞碎片懸液80μl，加入第2管血樣中，作為高碎片濃度干擾組，再將剩下紅細胞碎片懸液120μl加生理鹽水至1ml，取80μl加入第3管中，作為低碎片干擾組。將第4管加入80μl生理鹽水作為對照組。用PLT-I、PLT-0、PLT-F方法對上述第2、3、4管PLT進行檢測（檢測2次），以第2、3 管PLT測定值與第4管PLT測定值作配對t檢驗(n=10)。見表2。

表2　紅細胞碎片干擾試驗結果(n=10)

從表2可以看出使用SYSMEX XN全自動血細胞分析儀測定血小板的結果分別與自身對照組作配對t檢驗。由表4可以看出電阻抗法（PLT-I)易受到紅細胞碎片的干擾（高濃度組P<0.01，低濃度組P<0.05），而光學法（PLT-O）有一定的抗紅細胞碎片的干擾能力（高濃度組P<0.01，低濃度組P> 0.05），熒光核酸染色法（PLT-F)則有較強的抗紅細胞碎片干擾能力，不易受到血液中非血小板小顆粒影響[6]。

3　討論

血小板疾病是由于血小板數量減少或功能減退導致止血栓形成不良和出血而引起的。血小板減少癥可能源于血小板產生不足，脾臟對血小板的阻留，血小板破壞或利用增加以及被稀釋，無論何種原因所致的嚴重血小板減少，都可引起典型的出血。因此血小板計數是臨床常用的檢驗項目之一，其結果的準確性對于血栓性疾病和出血性疾病的診斷與治療起著決定性作用，特別低值血小板計數準確性一直是醫學檢驗和臨床關注的問題，當血小板<50×109/L患者出血風險大大增加，臨床癥狀可表現為出血，如鼻、齒齦、黏膜自發性出血等，應引起臨床醫生高度重視[7]，當血小板計數< 20×109/L，一般認為應進行預防性血小板輸血[8，9]。

目前血小板計數多使用各類血液分析儀完成，其計數原理多為經典的電阻抗法，但此方法受到的影響因素較多，目前認為影響因素主要為大血小板及小紅細胞、小血小板、血小板體積差異過大等[10-12]。為了保證血小板計數結果的準確性，Sysmex XN血液細胞分析儀可以采用電阻抗法，光學法和熒光核酸染色法三種方法對血小板進行檢測。阻抗法根據顆粒體積大小通過小孔時產生的脈沖信號不同來區別和計數血小板，而光學法和熒光核酸染色法采用了流式細胞術原理，根據對血小板核酸成份的熒光染色，測定熒光強度來計數血小板，消除了小紅細胞或紅細胞碎片的干擾[13]，其中光學血小板法使用聚甲烯次甲基熒光染料對血小板的核酸成份進行熒光染色，通過網織紅通道RET進行測量，利用表達細胞大小的前向散射光FSC和表達核酸濃度的側向熒光SFL來識別血小板。因血小板體積較紅細胞小，分布在紅細胞下方，血小板內含極少量的核酸，側向熒光的強度較成熟紅細胞稍大，因此能有效區分紅細胞和血小板。而熒光核酸染色法（PLT-F)較光學法（PLTO）多增加3倍PLT計數量，并針對血小板內內質網、線粒體進行嗪染料熒光染色，使血小板和碎片紅細胞間熒光強度差異變得更大，提高儀器辨別能力，減少非血小板顆粒干擾，通過血小板碎片干擾試驗可知熒光核酸染色法（PLT-F)有較強的抗紅細胞碎片干擾能力，不易受到血液中非血小板小顆粒影響，能準確檢測血小板計數。

血液分析儀一般采用浮動界標技術等來保證血小板計數的準確性，在一般情況下儀器可以區分血小板和紅細胞。但當血小板形態異常時，由于其形態不典型，直方圖易與紅細胞直方圖重疊，儀器不能進行準確計數[14]，此時應使用顯微鏡或流式細胞儀法對血小板計數結果進行復核[15]。但實際應用中由于光學法及熒光核酸染色法（PLT-F)成本較高，常規檢測工作中習慣使用阻抗法，當出現血小板計數<80×109/L、血小板直方圖異常、碎片紅細胞、小紅細胞及血小板聚集時，可使用光學法（PLT-O）或熒光核酸染色法（PLT-F)對血小板計數行進復檢，必要時涂片進行鏡檢。而國際血液學標準化委員會（ICSH）推薦的流式細胞術檢測血小板計數因費時成本高，標本保留時間短，且需要專業技術人員操作，常規血小板檢測工作中較少使用，一般應用于有條件臨床實驗室建立PLT參考方法并用于評價其它PLT計數方法[16]。

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·實驗研究·

中圖分類號：R446.11+1

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0288-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.010

基金項目：北京大學深圳醫院種子基金項目(編號：2015021）

作者簡介：陳娟，女，1980年5月生，醫學學士，主管技師，主要從事臨床醫學檢驗工作，wwwwzch@sohu.com。

(收稿日期2016-04-25；修回日期2016-05-16)

Accuracy evaluation of PLT - F method on low concentration of platelet counting

CHEN Juan，DONG Jing，PENG Saihui，WU Zhicheng. Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong Shenzhen 518036，China.

Abstract：Objective To evaluate the accuracy of PLT-F channel on low platelet counting in the SysmexXN-9000 automated hematology analyzer. Methods Blood samples with low platelet concentration or those mixed with erythrocyte fragments were detected with SysmexXN-9000 automated hematology analyzer using three platelet count methods：PLT-F，PLT-I，and PLT-O. As comparison，the samples were labeled with CD61 antibody，and analyzed using flow cytometry. Results PLT-F method showed higher reproducibility and accuracy in comparison with PLT-I method and PLT-O method. Platelet count by PLT-F method were less affected by erythrocyte fragments than that by PLT-O method. There was a better correlation between the PLT-F system and the immunological reference method，despite of samples with low platelet concentration. Conclusions This study revealed that PLT-I method can accurately count platelets in the clinical routine blood samples. However，blood samples with low platelet concentration or those containing erythrocyte fragment should be reviewed by PLT-O or PLT-F methods，even by microscopy or flow cytometry if necessary.

Key words:Platelet counting；PLT-F；Flow cytometry；Low platelet