微粒與凝血

易曉榕綜述，桂曉美，馮江審校

(1、南昌大學2015級研究生，江西　南昌330006；2、江西省人民醫院檢驗科，江西　南昌330006；3、南昌大學公共衛生學院，江西南昌330006)

?

·綜述·

微粒與凝血

易曉榕1綜述，桂曉美2，馮江3審校

(1、南昌大學2015級研究生，江西南昌330006；2、江西省人民醫院檢驗科，江西南昌330006；3、南昌大學公共衛生學院，江西南昌330006)

摘要：血栓性疾病嚴重威脅人類的生命健康，其發病率高居各種疾病之首，且近年來還有增加的趨勢，這成為了當代醫學研究的重點和熱點之一。研究發現，微粒對血栓的形成發揮了重要的作用，血栓性疾病患者體內的微粒含量增多。微粒通過多種途徑調節了與促凝相關的細胞因子，使機體處于高凝狀態。微粒對于血栓性疾病有重要的預測價值，本文就微粒的研究進展綜述如下。

關鍵詞：血栓；微粒；研究進展

馮江，男，1959年7月生，教授，專業：臨床檢驗診斷學。

隨著科技進步，人們對微粒（microparticles，MPs）的認識不斷提高。雖然目前MPs的產生過程還未被闡明，但人們普遍認為MPs是細胞活動和凋亡過程中通過細胞的胞吐作用產生的的微小囊泡，外膜為雙層脂質。微粒攜帶了許多生物信息（表1），這些成分可參與人體的各項活動[1]，如近年來血小板源性微粒（PMPs）的抗炎作用，血小板中含有脂氧酶12（LOX12），PMPs從血小板上脫落下來也含有LOX12，而肥大細胞內含有豐富的白三烯，PMPs與肥大細胞融合可以催化產生脂氧素A4 （Lipoxin A4），Tang K等人由此發現了誘導產生脂氧素的新方法，這為抗炎研究打開了一扇新的大門[2]。總之，MPs的與臨床疾病聯系緊密，具有重要的診斷和預測價值。

許多疾病到了一定階段會出現并發癥，部分患者發展成為血栓性疾病[3，4]，從而增加患者的死亡率。其間，除了我們所熟知的凝血因子、血小板等發揮作用外，MPs也在其中發揮了重要作用。有研究[5]報道關于胰腺癌的靜脈栓塞的試驗，結果發現許多細胞表達的組織因子（TF）增多并且檢測到了攜帶組織因子的微粒（TF-MPs）。

1　 MPs的產生

MPs可從血液、尿液等途徑獲得，MPs的直徑大約是100~1000nm。雖然MPs的產生過程還未被闡明，但人們普遍認為MPs是細胞活動和凋亡過程中通過細胞的胞吐作用產生的一種小囊泡。原本細胞膜表面的磷脂是不對稱分布，細胞釋放MPs時，在爬行酶等的作用下，部分磷脂如磷脂酰絲氨酸（PS）由膜內轉移至膜外，因此部分MPs表面攜帶了PS。人體內幾乎所有細胞都可以產生MPs，但對血細胞源性MPs的研究最為充分，這些細胞包括血小板、白細胞、紅細胞、巨噬細胞、內皮細胞、癌細胞等，血液中的MPs主要是由血小板釋放的[6]，約占70%~90%，含有豐富的母體細胞的表面蛋白、脂質和胞質成分，如表面受體、細胞因子、磷脂、信使核糖核酸（mRNA）和小分子核苷酸（microRNA）。MPs的生命半周期平均約為5.8h[7]。

表1　MPs的作用

2　 MPs的促凝作用

MPs的促凝作用主要是通過TF、黏附分子、PS來發揮促凝作用。

2.1TF MPs表面可以表達TF。不同細胞來源的MPs表達的TF活性不同，如血小板源性微粒表達的TF活性較弱，而癌細胞源性微粒表達的TF活性較強。MPs表達的TF通過與凝血因子Ⅶ/活化凝血因子Ⅶa（FⅦ/FⅦa）結合而啟動外源性凝血反應。MPs表面的TF含量不同，凝血的效果也不同，TF含量少的MPs所形成的血栓的重量、大小都低于TF含量多的MPs。

2.2黏附分子MPs可以表達黏附分子，從而使MPs與細胞相互作用、相互誘導，產生一系列的反應，使細胞表達更多的促凝物質，從而促進凝血反應。如內皮細胞源性的MPs可以表達P選擇素糖蛋白配體（PSGL）、細胞間黏附分子（ICAM）等，與單核細胞表面的β2整合素相互作用，從而使單核細胞表面表達的TF增多，且單核細胞內的TF-mRNA也增多。

2.3PS MPs表面可以表達PS，PS是通過組裝MPs表面依賴鈣離子的凝血因子來促進凝血。當CaCl2濃度在4~6mM時，絕大部分PS暴露在膜外。PS可以選擇性地結合FⅤ、FⅧ的C樣結構域，為FⅤa、FⅧa和FⅩa的形成提供催化表面，促進凝血酶形成。PS還可以增強TF/FⅦa復合物的組裝與催化活性，促進外源性凝血途徑的發生。膜表面的PS有助于凝血復合物的形成以及促進TF誘導的凝血[8]，加速凝血反應。MPs表面的PS只能夠加速凝血反應，并不能單獨誘導凝血發生。

3　 MPs的抗凝功能

MPs除了有促凝作用外還有抗凝作用，如向心肌梗死小鼠注射MPs可以使心肌功能增強，心率（HR）、左心收縮壓（LVSP）等增強[9]。這對人體正常運行具有重要意義。MPs的抗凝物質有組織因子途徑抑制劑（TFPI）、纖維蛋白溶酶原、活化蛋白C （APC）。在正常健康人體內，這些物質會與促凝因子達到平衡，從而避免了凝血功能紊亂。

3.1組織因子途徑抑制物TFPI通過調節TF-FⅦ復合物，從而避免了凝血紊亂[10]。表達TFPI的MPs主要是由內皮細胞[11]、單核細胞[12]、癌細胞[13]產生，循環MPs是由心肌梗死和糖尿病[14]患者產生的。所有MPs表面TFPI和TF的平衡影響了血栓形成，在不同的疾病階段，TFPI和TF的比例不同。這種平衡不僅可以反應的患者是否處于高凝狀態，還可以幫助判斷血栓的危險程度[15]。

3.2纖溶酶原激活劑白細胞、內皮細胞、癌細胞源性微粒表面有尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA）或者組織型纖溶酶源激活劑（t-PA），這些細胞在不同病理環境下可以發揮纖溶作用。t-PA結合纖維蛋白增加了MPs與纖維蛋白溶酶原的親和力，u-PA活化纖維蛋白溶酶原使纖維蛋白溶酶原的分子組合變成纖維蛋白溶酶[16]。

3.3內皮細胞蛋白C受體（EPCR）當具有抗凝活性的APC與EPCR結合，通過血栓-血栓調節蛋白復合物提高了APC的活性[17]，從而滅活FVa、FⅧa因子，減少凝血酶的產生，從而發揮抗凝作用。

3.4含有ω-3多不飽和脂肪酸的二十五碳烯酸（EPA）據研究[18]表明，服用含有ω-3多不飽和脂肪酸的二十五碳烯酸（EPA）可以顯著抑制血小板的聚集，降低PMPs的活性，延長凝血時間，但這些作用在男性中更加明顯。

4　不同來源的MPs的功能

不同來源的MPs表面表達的促凝物質的種類和活性各不相同，在促進血栓形成過程中發揮作用的方式也不同，人們認為MPs通過以下幾種方式與細胞相互作用，從而促進凝血反應：⑴與靶細胞表面配體結合，從而使蛋白質重新分布；⑵通過結合到靶細胞膜獲得新的抗原，從而呈現一種新的特點；⑶通過細胞外環境的調節與靶細胞相互作用，如調節局部氧壓；⑷通過融合內化來影響基因調節[19，20]。

4.1血小板源性的MPs（PMPs）據報道，PMPs在健康人群中的含量最多，大約有70%~90%。PMPs表面的促凝受體比血小板多很多，促凝活性是血小板的100倍。PMPs表面的信號分子包括miRNA、生長因子、有絲分裂原等，通過這些信號分子，PMPs可以介導細胞之間的相互作用，調節細胞的功能活性。PMPs被認為是具有生物活性的血管感受器，是促凝磷脂的儲蓄池，是調節止血平衡的重要物質。PMPs在血栓形成部位大量聚集，促進血栓形成的機制可能是：⑴表達在PMPs外膜的PS可以結合FⅡa、FⅤa、FⅧ、FⅨa，為凝血酶的形成提供催化表面，加速凝血酶的形成；⑵PMPs表面表達糖蛋白受體GPⅡb/Ⅲa可以與纖維蛋白原、血管性血友病因子（vWF）、纖維連接蛋白以及膠原結合，形成纖維蛋白網；⑶血小板釋放PMPs時，使PMPs攜帶了血小板活化因子（PAF），當PMPs被激活時，PAF激活血小板發揮促凝作用；⑷PMPs表面表達TF，它可以與FⅦa結合，活化FⅩ，啟動外源性凝血途徑，從而觸發凝血反應；⑸PMPs與細胞間也可以相互作用，如PMPs與單核細胞相互作用，可以增加單核細胞表面表達TF。增加PMPs的含量可以促進血小板的黏附和聚集，增強凝血因子的活性，從而促進血栓形成。在血管疾病和血小板聚集活動中，循環PMPs的含量顯著增加。血栓病人體內PMPs的增加可能是因為血小板極易被激活，從而產生較多的PMPs。冰凍儲存的血小板血漿在一定時間范圍內可以表達大量的TF和PS，但若是儲存時間過長TF和PS含量反而會減少[21]。急性冠狀動脈綜合征患者的冠狀動脈處的PMPs含量比外周血中PMPs多，這些PMPs增加了血小板的活性，使血小板相互聚集，PMPs表面的TF、PS等也發揮作用，從而促使血栓形成[22]。

4.2白細胞源性MPs（LMPs）LMPs在內皮細胞中既可以提高內皮細胞功能，又可以誘導內皮細胞功能喪失，在這過程中LMPs調整內皮細胞功能，增加炎性細胞在血管壁聚集，損傷內皮細胞，這一過程對于動脈粥樣硬化形成過程很重要，LMPs參與了動脈粥樣硬化形成的所有階段。LMPs還參與了促凝、血小板活化、血管形成。

4.2.1單核細胞源性的MPs（MoMPs）從單核細胞懸液中提取的MoMPs表面共同表達了促凝的TF和凝血酶調節蛋白，也表達黏附分子如CD15或者P選擇素糖蛋白配體（PSGL-1），通過結合P選擇素減少激活的血小板，從而導致在血栓和纖維蛋白形成過程中TF的聚集。從腦膜炎球菌、鐮刀形貧血癥患者體內獲得的單核細胞表達TF，HIV患者血液中的單核細胞表面還可以表達大量的TF[23]。源于人類急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）的單核細胞可以表達CD15，它可以調節MoMPs與活化血小板上P選擇素的結合，在凝血酶內通過PSGL-1途徑，MoMPs可以被活化的血小板捕獲，從而使TF聚集以及加劇了纖維蛋白的沉積。Maria Letizia等人的研究表明，凋亡單核細胞源性的MPs可以通過減少小窩蛋白的含量以及提高小窩蛋白磷酸化水平，增強對內皮細胞的硝化作用，損傷內皮細胞，引發了凝血反應。

4.2.2中性粒細胞源性MPs（NMPs）在低氧環境中，由中性粒細胞源釋放的表達TF或PS增多，帶負電荷的PS可以和FV、FVIII、FX形成凝血復合物，加劇了體內的凝血反應。根據Chen YC等人的試驗表明在高氧環境中鍛煉可以減緩中性粒細胞源性的MPs的釋放，以及減少其表面表達的PS和/或TF的表達，這對于機體抗凝有重要意義[24]。NMPs包含巨細胞抗原1（αMβ2），調節與其余血小板相互作用的，血小板被激活，表面的P選擇素表達增加以及血栓形成。另外，表達αMβ2的NMPs與尿激酶、纖溶酶原和金屬基質蛋白酶-2和-5相互作用，表明NMPs可以在纖維蛋白溶解和組織重構中發揮作用。

4.2.3淋巴細胞源性MPs淋巴細胞源性的MPs包括T細胞源性微粒（TMPs）、B細胞源性微粒（BMPs）、自然殺傷細胞源性微粒（NMPs）。攜帶Fas配體（FasL）的TMPs通過Fas-FasL途徑與平滑肌細胞相互作用，激活了NFκB，增加了NO合成酶和環氧合酶-2的表達，損傷內皮細胞，引起凝血反應。

4.3紅細胞源性微粒人們對紅細胞源性微粒關注較少。由于紅細胞的流變學特性，這些紅細胞源性的微粒可以進入細胞內部[25]，從而增加它們與血紅蛋白和氮氧化物的相互作用以及使內皮細胞功能障礙，損壞內皮細胞，從而引發凝血。紅細胞源性微粒可以預測血栓進展。

4.4巨噬細胞源性MPs來源于動脈血管壁內聚集的單核細胞，在刺激動脈粥樣硬化方面巨噬細胞源性的MPs是最主要的。動脈粥樣硬化處巨噬細胞源性的MPs可以表達CD40配體（CD40L），促進內皮細胞增生。它們還可以促進纖維帽內淋巴細胞活性和血管生成。

4.5內皮細胞源性MPs（EMPs）當內皮細胞受損或炎癥調節因子破壞內皮細胞時，EMPs就會被釋放出來。從某一個方面來說EMPs是連接凝血與炎癥的橋梁。EMPs表面呈現不同的抗原，如TF、凝血酶調節蛋白（TM）、內皮細胞蛋白C受體（EPCR），當機體處于凝血狀態時，EMPs會上調表達TF，而下調TM和EPCR。許多研究表明，心血管疾病患者體內的EMPs含量較多，如在動脈栓塞患者，不穩定斑塊處的EMPs含量比穩定斑塊處的多。EMPs可以促進或抑制血管產生，它發揮哪種功能，這取決于刺激物的作用，如凝血酶通過增加TRAIL/TRAIL-R2的表達，從而使內皮細胞釋放EMPs，從而促進凝血反應。

4.6癌細胞源性MPs癌細胞也可以釋放MPs，人類不同起源的癌細胞表達了不同水平的TF。這些MPs也表達PSGL1，還可以激活凝血因子，以及誘導血小板聚集。據報道，癌細胞可以促進血栓的形成，而向小鼠體內注射富含TF的癌細胞源性的MPs，形成的血栓大小和重量與直接注射癌細胞相同。癌癥患者中TF-MPs的含量與由D二聚體含量所決定的凝血因子的活性有關[26]。

許多癌癥患者會采用化學治療，殺死癌細胞的同時，也損傷了體內的細胞，這也會加劇血栓的形成[27，28]。服用具有細胞毒性的藥物會增加TF的活性以及使MPs表面暴露更多的PS。在化學治療過程中主要是由內皮細胞和白血病細胞釋放含有PS或者TF活性的MPs的[29，30]。因此治療癌癥不僅要去除癌細胞，還要防止其他并發癥的危害。化學療法最大的障礙是藥物抵抗（MDR），通過轉運P選擇素糖蛋白（P-gp）和mRNA到癌細胞源性的MPs，MPs可以在癌細胞間傳播MDR[31，32]。

5　 MPs的檢測

檢測MPs最常用的方法是流式細胞儀檢測技術，流式細胞儀利用MPs的大小將MPs與其它外泌體區分開來。但由于MPs分子直徑（100~ 1000nm）變化較大，以及流式細胞儀自身的局限性，一部分較小的MPs無法被檢測到，最終會導致結果出現偏差。經過人們的不斷探索，人們發現利用MPs表面暴露PS這一特性和Annexin V與PS的高親和性，用包被Annexin V的磁珠來捕獲MPs，再用流式細胞儀分析，這樣也可以檢測出MPs的含量。利用包被Annexin V的磁珠捕獲TFMPs這一方法的靈敏度、特異度比單純使用流式細胞儀更高[33]。這一方法也存在缺陷，并非所有的MPs都表達PS，所以仍然不能檢測到部分的MPs。還有一種利用抗PS抗體的熒光檢測技術與用包被Annexin V的磁珠捕獲MP的原理一樣，是利用抗原抗體反應來檢測。

僅僅使用流式細胞儀只能分離出MPs，但不能確定MPs的來源。若想要確定MPs的細胞起源，就要加入相應的熒光抗體，通過熒光分析來確定MPs的來源。根據不同起源細胞起源的MPs表面標記物不同（表2），如血小板源性的MPs表面標記物是CD41和Annexin V，根據MPs大小和表面標記物，可以更準確地檢測出不同來源的MPs。

6　總結

MPs是細胞活動或凋亡過程中產生的囊泡，它不僅在疾病狀態時可以檢測到，在健康正常人體內也可以檢測到。Berckman等人發現在健康正常人體內這些循環的MPs含量較少，只是參與了低程度的血栓產生。由于MPs的產生過程以及測量金標準都還未被發現，我們仍然需要不斷探索，它對于預測疾病有重要的價值。MPs不僅僅有促進凝血的功能，還有抑制凝血的功能，當促凝作用大于抗凝作用時，機體出現血栓；當抗凝作用大于促凝作用時，就會抑制血栓的出現。針對不同的疾病情況，使MPs發揮不同的功能，這是一個非常值得探索的問題。

表2　不同白細胞來源的MPs表面標記物

參考文獻

[1]Mause SF，Weber C. Microparticles：protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange[J]. Circ Res 2010，107(9)：1047-1057.

[2]Tang K，Liu J，Yang JS，et al. Microparticles mediate enzyme transfer from platelets to mast cells：A new pathway for lipoxin A4 biosynthesis[J]. Biochem Biophys Res Commun，2010，400(3)：432-436.

[3]Menapace LA，Peteraon DR，Berry A，et al. Symptomatic and incidental thromboembolismare both associated with mottality in pancreatic cancer[J]. Thromb Haemost，2011，106(2)：371-378.

[4]Mackman N. New insights into the mechanisms of venous thrombosis[J]. Clin Invest，2012，122(7)：2331-2336.

[5]Wang JG，Geddings JE，Aleman MM，et al. Tumor-derived tissue factor activates coagulation and enhances thrombosis in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer [J]. Blood. 2012，119 (23)：5543-5552.

[6]Angelillo-Scherrer A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis[J]. Cir Res，2012，110(2)：356-369.

[7]Rank A，Nieuwland R，Crispin A，et al. Clearance of platelet microparticles in vivo[J]. Platelets，2011，22(2)：111-116.

[8]Morel O，Toti F，Jesel L，et al. Mechanisms of microparticle generation：on the trail of the mitochondrion! [J]. Semin Thromb Hemost，2010，36(8)：833-44.

[9]Ma F，Liu C，Shen Y，et al. Platelet-derived microvesicles are involved in cardio-protective effects of remote preconditioning[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(9)：10832-10839.

[10]Aharon A，Brenner B. Microparticles，thrombosis and cancer [J]. Best Pract Res Clin Hematol，2009，22(1)：61-69.

[11]Tilley RE，Holscher T，Belani R，et al. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients[J]. Thromb Res，2008，122(5)：604-609.

[12]Sabatier F，Camoin-Jau L，Anfosso F，et al. Circulating endothelial cells，microparticles and progenitors：key players towards the definition of vascular competence[J]. Cell Med，2009，13(3)：454-471.

[13]Zwicker JI. Predictive value of tissue factor bearing microparticles in cancer associated thrombosis [J]. Thromb Res，2010，125(Suppl 2)：S89-S91.

[14]Rak J. Microparticles in cancer [J]. Semin Thromb Hemost，2010，36(8)：888-906.

[15]Zwicker JI. Predictive value of tissue factor bearing microparticles in cancer associated thrombosis [J]. Thromb Res，2010，125(Suppl 2)：S89-S91.

[16]Reynés G，Vila V，Fleitas T，et al. Circulating endothelial cells and procoagulant microparticles in patients with glioblastoma：prognostic value[J]. PLoS One，2013，8(7)：e69034.

[17]Meziani F，Delabranche X，Asfar P，et al. Bench-to-bedside review：circulating microparticles：a new player in sepsis? [J]. Crit Care，2010，14(5)：236.

[18]Macey MG，Enniks N，Bevan S. Flow cytometric analysis of microparticle phenotype and their role in thrombin generation[J]. Cytometry B Clin Cytom，2011，80(1)：57-63.

[19]Mause SF，Weber C. Microparticles：protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange [J]. Circ Res，2010，107(9)：1047-57.

[20]Van der Pol E，Coumans F，Varga Z，et al. Innovation in detection of microparticles and exosomes[J]. Thromb Haemost，2013，11(Suppl. 1)：36-45.

[21]Lacey J，Craig P，Cand DC. The hemostatic activity of cryopreserved platelets is mediated by phosphatidylserine -expressing platelets and platelet microparticles [J]. Transfusion，2014，54(8)：1917-1926.

[22]Suades RT，Padró J，Crespo I，et al. Circulating microparticle signature in coronary and peripheral blood of ST elevation myocardial infarction patients in relation to pain-to-PCI elapsed time[J]. Int J Cardiol，2016，202：378-387.

[23]Funderburg NT，Mayne E，Sieg SF，et al. Increased tissue factor expression on circulating monocytes in chronic HIV infection：relationship to in vivo coagulation and immune activation [J]. Blood， 2010，115(2)：161-167.

[24]Chen YC，Ho CW. Interval and continuous exercise regimens suppress neutrophil-derived microparticle formation and neutrophilpromoted thrombin generation under hypoxic stress [J]. Cli Sci，2015，128(7)：425-436.

[25]Liu C，Zhao W，Christ GJ，et al. Nitric oxide scavenging by red cell microparticles[J]. Free Radic Biol Med，2013，65：1164-1173.

[26]Hron G，Kollars M，Weber H，et al. Tissue factor -positive microparticles：cellular origin and association with coagulation activation in patients with colorectal cancer [J]. Thromb Haemost，2007，97(1)：119-123.

[27]Menapace LA，Peteraon DR，Berry A，et al. Symptomatic and incidental thromboembolism are both associated with mottality in pancreatic cancer[J]. Thromb Haemost，2011，106(2)：371-378.

[28]Falanga A，Marchetti M，Russo L. Venous thromboembolism in the hematologic malignancies [J]. Curr Opin Oncol，2012，24 (6)：702-710.

[29]Fu Y，Zhou J，Li H，et al. Daunorubicin induces procoagulant activity of cultured endothelial cells through phosphatidylserine exposure and microparticles release [J]. Thromb Haemost，2010，104 (6)：1235-1241.

[30]Zhou J，Shi J，Hou J，et al. Phosphatidylserine exposure and procoagulant activity in acute promyelocytic leukemia [J]. Thromb Haemost，2010，8(4)：773-782.

[31]Jaiswal R，Gong J，Sambasivam S，et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer [J]. FASEB，2012，26(1)：420-429.

[32]Jaiswal R，Luk F，Dalla PV，et al. Breast cancer -derived microparticles display tissue selectivity in the transfer of resistance proteins to cells[J]. PLoS One，2013，8(4)：e61515.

[33]Frank G，Hans G. Using annexin V -coated magnetic beads to capture active tissue factor-bearing microparticles from body fluids [J]. Cell Biol Int，2014，38(2)：277-281.

中圖分類號：R364.1+5

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0322-05

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.019

基金項目：江西省教育廳科技落地計劃項目（編號：KJLD12013）

作者簡介：易曉榕，女，1993年3月生，醫學學士學位，專業：臨床檢驗診斷學，研究方向：凝血。

通信作者：桂曉美，女，1963年10月生，主任技師，專業：臨床檢驗診斷學，研究方向：老年疾病及代謝性疾病的生化檢測。

(收稿日期2016-01-21；修回日期2016-05-16)