加味苓桂術甘湯對腎纖維化大鼠腎組織TGF-β1表達的影響

董小君　丁　斗　劉厚穎　王玲玲

1.遵義醫藥高等專科學校中醫系，貴州　遵義　563002；2.成都中醫藥大學基礎醫學院，四川　成都　610075；3.貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州　貴陽　550002

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加味苓桂術甘湯對腎纖維化大鼠腎組織TGF-β1表達的影響

董小君1，2丁斗1?劉厚穎3王玲玲3

1.遵義醫藥高等專科學校中醫系，貴州遵義563002；2.成都中醫藥大學基礎醫學院，四川成都610075；3.貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州貴陽550002

【摘要】目的：觀察加味苓桂術甘湯對大鼠腎纖維化模型的影響，并探討其可能的作用機制。方法：將40只Wistar雄性大鼠隨機分為4組：正常對照組、模型對照組、低劑量加味苓桂術甘湯組與高劑量加味苓桂術甘湯組。按200mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃建立大鼠腎纖維化模型。28d后采集血液標本，檢測大鼠血清BUN、Cr水平的變化；留取腎組織，用于HE染色觀察腎組織病理改變及免疫組化方法檢測腎組織TGF-β1的表達。結果：模型對照組血清BUN、Cr、腎組織TGF-β1較正常對照組明顯升高，加味苓桂術甘湯各組上述指標較模型對照組明顯下降。結論：加味苓桂術甘湯可保護腎功能，通過下調TGF-β1表達延緩腎纖維化進展。

【關鍵詞】加味苓桂術甘湯；腎纖維化；TGF-β1

腎纖維化(renal fibrosis，RF)是不同病因的慢性腎病進展到終末期腎衰竭的共同通路和病理基礎，其發生機制錯綜復雜，涉及細胞、細胞外基質和生長因子之間的相互作用[1]。其中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公認的最強致纖維化因子，細胞外基質的沉積與之密切相關，是促進腎臟疾病進展的重要因素。苓桂術甘湯源自《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，原為中陽不足之痰飲而設，以溫陽化飲，健脾利濕為用。課題組根據多年臨床經驗，在原方基礎上，擬定出具有補腎健脾、通絡消癥功效的加味苓桂術甘湯。臨床上用該方治療慢性腎臟病，取得了較好的療效。為進一步探討加味苓桂術甘湯對腎纖維化的影響，本研究用腺嘌呤灌胃制作大鼠腎纖維化模型，通過觀察加味苓桂術甘湯對腎組織TGF-β1的影響，從細胞分子水平探討該方抑制腎纖維化的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性Wistar大鼠40只，體重200～250g，清潔級，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黔)2012-0001。

1.2藥品與試劑加味苓桂術甘湯由土茯苓、桂枝、白術、炙甘草、法半夏、黃連、大黃、六月雪、淫羊藿、熟地、黃芪、太子參、三七、丹參、當歸、車前子、川芎等組成，以上中藥均購自貴陽中醫學院第二附屬醫院門診草藥局，制成低劑量含生藥量1.48g/ml與高劑量含生藥量2.96g/ml的中藥水煎液，4℃恒溫冰箱保存；腺嘌呤購自昆明騰科科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體，SABC免疫組織化學試劑盒，DAB顯色劑，購自武漢博士德生物有限公司。

1.3動物分組與實驗方法將40只雄性Wistar大鼠隨機分為4組，分別為正常對照組(Ⅰ組)、模型對照組(Ⅱ組)、低劑量加味苓桂術甘湯組(Ⅲ組)與高劑量加味苓桂術甘湯組(Ⅳ組)。造模根據文獻報道[2]，結合預實驗，制備濃度為2.5%的腺嘌呤混懸液(每1g腺嘌呤溶于40ml生理鹽水)，按200mg/(kg·d)腺嘌呤給模型對照組和低劑量、高劑量加味苓桂術甘湯組連續灌胃28d(正常對照組給予同等劑量的生理鹽水)，誘發腎纖維化模型。實驗第8天開始進行中藥預防干預，用藥劑量按照施新猷[3]動物與人的藥物劑量換算方法換算得出，低、高劑量加味苓桂術甘湯組分別按生藥22.2、44.4g/(kg·d)灌胃，持續給藥3周，正常對照組與模型對照組每天給予3ml的生理鹽水。

1.4標本采集與指標檢測實驗第29天采集標本，采集標本前禁水12h，禁食8h。將全部大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉后，股動脈取血5ml，靜置20min，3000r/min離心10min后分離血清，用全自動生化分析儀測血尿素氮(BUN)，血肌酐(Cr)含量。采血后即刻摘取大鼠腎臟，放入10%中性甲醛中固定，常規脫水石蠟包埋，用于HE染色及免疫組織化學檢查。免疫組化結果應用麥克奧迪數碼醫學圖像分析系統進行半定量分析[4]，每組選10張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機檢測10個不重疊視野，視野內棕黃色染色區域為陽性表達，以TGF-β1陽性顆粒的平均光密度來反映 TGF-β1的表達水平。

2結果

2.1對大鼠一般情況的影響實驗第8天開始，模型對照組大鼠出現精神萎靡，食欲下降，體質量增長緩慢，毛色干枯，耳廓蒼白，目色淡紅，瞇眼，眼瞼浮腫，尾巴濕冷，行動遲緩等現象。低、高劑量大鼠的精神狀態優于模型對照組。正常對照組大鼠精神狀態良好，攝食正常，毛色光亮，耳廓紅潤，活動度大。實驗過程中，模型對照組與低劑量加味苓桂術甘湯組，各死亡1只動物。

2.2腎功能的檢測與正常對照組比較，模型對照組、低劑量加味苓桂術甘湯組大鼠血清BUN、Cr水平顯著或極顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與模型對照組比較，低、高劑量加味苓桂術甘湯組血清BUN、Cr水平極顯著下降(P<0.01)；加味苓桂術甘湯各組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3病理學檢測光鏡下模型對照組與各加味苓桂術甘湯組大鼠腎組織均有不同程度的損傷，其中模型對照組損傷最重，高劑量加味苓桂術甘湯組損傷最輕。正常對照組腎小球、腎小管及腎間質未見異常。模型對照組腎小管上皮細胞彌漫空泡變性，纖維組織增生及炎細胞浸潤，近球小管管腔內見異物結晶體，結晶體呈放射狀，有金屬光澤，部分皮質間質內可見中性粒細胞進入，部分腎小管管腔內也見中性粒細胞堆積。低劑量加味苓桂術甘湯組腎臟病變較模型對照組減輕，少許腎小管上皮細胞腫脹，腎間質內炎性細胞呈小灶狀浸潤，纖維組織增生面積較小且局限。高劑量加味苓桂術甘湯組腎臟病理改變較模型對照組明顯減輕，腎間質未見明顯纖維化。見圖1。

組別nBUN/mmol/LCr/μmol/LI組1013.09±1.24 67.40±4.37 II組936.38±3.57##160.18±20.75## III組916.33±0.91#△△ 81.40±3.33#△△IV組1014.27±1.62△△75.68±5.17△△

注：與Ⅰ組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Ⅱ組比較，△△P<0.01。

2.4TGF-β1表達半定量分析與正常對照組比較，余各組TGF-β1表達均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，加味苓桂術甘湯各組均顯著下降(P<0.01)；加味苓桂術甘湯各組間TGF-β1差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1表達比較　

組別nTGF-β1(平均積分光密度)I組109.49±0.50II組9151.94±15.52##III組988.40±16.74##△△IV組1084.80±10.73##△△

注：與Ⅰ組比較，##P<0.01；與Ⅱ組比較，△△P<0.01。

3討論

中醫認為，腎纖維化屬于“溺毒”、“關格”、“水腫”等范疇[5]，其主要病機為脾腎虧虛、濕濁內蘊、瘀毒壅滯。課題組根據多年臨床經驗總結出具有補腎健脾、通腑泄濁、活血祛瘀功效的加味苓桂術甘湯。方中黃芪、太子參、茯

苓、白術益氣健脾，促進脾胃運化和氣機升降恢復；熟地、淫羊藿、桂枝補腎填精溫陽；大黃、黃連、車前子、半夏、六月雪利濕祛毒；當歸、丹參、三七、牛膝、川芎養血活血化瘀。諸藥合用，共奏扶正祛邪，通絡消癥之效。通過臨床觀察發現該方能夠緩解慢性腎衰患者臨床癥狀和體征，降低血清尿素氮、肌酐水平，改善腎小球濾過率。

多種細胞因子參與了腎纖維化的病理過程，主要影響腎小管細胞增生、肥大、凋亡及細胞外基質(ECM)合成等。其中，TGF-β1是促進ECM合成與沉積的重要因子， 促進腎小管上皮細胞轉化，打破腎間質細胞外基質代謝的動態平衡，使其向纖維化方向發展。TGF-β1幾乎參與腎纖維化的各個環節，是誘導腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞的中心環節。因此對抗TGF-β1以阻止腎臟纖維化對治療慢性腎功能衰竭具有重要意義，也成為一個公認的治療靶點[6]。

研究通過加味苓桂術甘湯治療腎纖維化大鼠及其對腎組織TGF-β1表達發現，加味苓桂術甘湯能降低腎纖維化大鼠血清BUN、Cr水平，且高劑量加味苓桂術甘湯組效果更明顯。同時，經腺嘌呤灌胃后，模型對照組大鼠腎臟組織均出現不同程度的纖維化，TGF-β1呈現過度表達狀態，而用加味苓桂術甘湯干預后的各組TGF-β1表達均明顯減少，表明加味苓桂術甘湯可明顯保護腎功能，通過下調腎組織內的TGF-β1表達，降低細胞外基質合成，從而延緩腎纖維化的進展。

參考文獻

[1] 劉燕霞，史國輝．腎康注射液對腺嘌呤致腎間質纖維化的預防機制[J]．中國醫學前沿雜志，2012，4(9)：47-51．

[2] 邱模炎，姜岳，趙宗江，等．真武湯抗大鼠腎間質纖維化作用的研究[J]．中國實驗方劑學雜志，2010，16(17)：177-180．

[3] 施新猷．現代醫學實驗動物學[M]．北京：人民軍醫出版社，2000：332-335.

[4] 魏仲南，朱淑瑜，杜銳格．補腎祛毒湯對腺嘌呤腎衰竭大鼠腎臟-β1、HGF表達的干預作用[J]．中國中西醫結合腎病雜志，2012，13(4)：326-328.

[5] 梁亮，崔長樂，何學紅．參芪泄濁飲對腺嘌呤腎間質纖維化模型大鼠腎組織 MMP-9、TIMP-1基因表達的影響[J]．遼寧中醫雜志，2015，42(1)：190-193．

[6] 雷根平，王婷，任艷蕓，等．加味薯蕷丸對腺嘌呤所致慢性腎功能衰竭大鼠TGF-β1的影響[J]．時珍國醫國藥，2012，23(9)：2224-2226．

基金項目：遵義科技局青年人才項目(遵市科合社字[2012]30號)。

作者簡介：董小君(1983-)，女，江蘇靖江人，講師，2015級博士研究生，主要從事方劑功效發揮機理及應用的研究。E-mail：57229463@qq.com. 通信作者：丁斗(1980-)，男，貴州遵義人，副教授，主要從事中醫內科學。E-mail：dingdou1980@sina.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)12-0053-02

(收稿日期：2016.04.18)

Effects of Jiawei Lingguizhugan Decoction on Expression of TGF-β1 in Renal Fibrosis Rats

DONG Xiaojun1,2DING Dou1?LIU Houying3WANG Lingling3

1.Traditional Chinese Medical Department of Zunyi Medical College，Zunyi 563002，China；2.Basic Medical College of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China；3.The second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medical College，Guiyang 550002，China

Abstract:Objective To observe the effects of Jiawei Lingguizhugan decoction in renal fibrosis rats and explore its possible mechanism. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into four groups，namely the control group，the model group，the low-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group and the high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group. The models of renal fibrosis were established by intragastric administration of adenine200mg/(kg·d). The blood samples were collected after 28 days. The changes of blood urea nitrogen and creatinine were detected. The kidney pathological changes were observed by light microscopy with HE-staining. The expression of TGF-β1 was determined by immunohistochemical method. Results Blood urea nitrogen，creatinine and TGF-β1 of the model group were markedly increased than that of the control group. The above indicators were lower in the low-dose and high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction groups than those in the model group. Conclusions Jiawei Lingguizhugan decoction could protect the kidney function and postpone renal fibrosis by decreasing the expression of TGF-β1 in renal tissues.

Key words:Jiawei Lingguizhugan Decoction；Renal Fibrosis；TGF-β1