葉片山海綿水溶性活性產物的大孔吸附樹脂分離及其抗腫瘤活性

賀騰飛，羅聯忠，陳　軍*，王德祥，丁少雄

(1.廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102;2.廈門醫學院藥學系，福建廈門361005)

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葉片山海綿水溶性活性產物的大孔吸附樹脂分離及其抗腫瘤活性

賀騰飛1，羅聯忠2，陳軍1*，王德祥1，丁少雄1

(1.廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102;2.廈門醫學院藥學系，福建廈門361005)

摘要：海綿擁有豐富的生物活性產物，以葉片山海綿(Mycale phyllophila)為材料，建立了以DA201-C大孔吸附樹脂為核心的從水提液中提取活性產物的方法.以Lowry法跟蹤得率，此方法對小分子肽類的回收率約為57%；粗提物的主要成分為肽類，約占89%.細胞活性檢測表明粗提物對C6神經膠質瘤細胞、A2780-CP卵巢癌順鉑耐藥細胞和HepG2肝癌細胞具有明顯的抑制作用.本工作為深入研究葉片山海綿水溶性活性產物中的抗腫瘤組分奠定了基礎.

關鍵詞：海綿；大孔吸附樹脂；肽類；抗腫瘤活性

海綿屬于多孔動物門(Porifera)，是最原始的多細胞動物.海綿擁有豐富的生物活性產物，在目前發現的20 000多種海洋天然活性產物中，有7 000多種來自海綿[1-2]，海綿作為最重要的海洋藥源生物越來越為醫藥界所重視.目前發現的海綿活性產物絕大部分是通過有機萃取方法富集起來的，這種方法對親水性較強的組分提取效率可能較低，而且一些組分尤其是肽類組分的生物活性也可能會在長時間的有機溶劑處理后丟失.葉片山海綿(MycalephyllophilaHentschel，1911)在福建沿海分布較為廣泛，本課題組對其開展了種屬鑒定、原位移植和生活史等研究工作[3-5].本研究以葉片山海綿為實驗材料，建立了適合于水溶性活性產物尤其是小分子肽類的大孔吸附樹脂富集方法，細胞活性檢測證明了該方法獲得的肽類粗提物具有明顯的抗腫瘤活性.

1材料與方法

1.1材料

葉片山海綿采自福建省東山灣古雷附近的漁排，將海綿離心脫水后置于-80 ℃冰箱保存.

1.2海綿破碎和水提

稱取冷凍干燥后的葉片山海綿380 g，高速粉碎機粉碎；4 ℃條件下，粉末浸泡于1.2 L水提液(10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，1.5 μmol/L抑肽酶，20 μmol/L苯硫脲，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))中充分攪拌20 min.冰上超聲破碎，輸出功率100 W，運行5 s，停止15 s，總運行時間15 min；4 ℃，8 000g離心15 min；將沉淀重懸于1.2 L水提液中.如此反復重懸、超聲、離心4次，得合并后的上清約4.5 L，Lowry法檢測其中肽類的濃度.

1.3超濾

采用PALL Centramate超濾系統切向流過濾上述上清液，先以2個MWCO300K膜包(PALL，美國)并聯過濾，濾過液再以2個MWCO1K膜包(PALL，美國)并聯過濾.每級過濾的截留液體積剩余約200 mL時加入1 L純水繼續過濾，直至截留液剩余約200 mL.最終獲得約6 L MWCO1K膜包濾過液，將其命名為組分1，Lowry法檢測肽類濃度.

1.4大孔吸附樹脂富集水溶性活性產物

1.4.1評價4種大孔吸附樹脂對水溶性肽類的靜態吸附-解吸附效率

按照說明書處理4種大孔吸附樹脂：DA201-C、AB-8、D101和NKA-9(均購自鄭州勤實科技有限公司)；各取10 mL 樹脂與50 mL 組分1混合，4 ℃層析柜中搖床震蕩；在混合后2,4,6，16 h各取50 μL上清用Lowry法測定肽類濃度；16 h后去上清，純水洗滌5次，抽干液體，加10 mL 70%(體積分數，下同)乙醇，震蕩2 h，Lowry法測定溶液的肽類濃度.重復3次，計算靜態吸附率和解吸附率.

1.4.2富集葉片山海綿水溶性活性產物

4 ℃層析柜中，將剩余約5 L 組分1與1.5 kg DA201-C大孔吸附樹脂攪拌混合12 h；純水漂洗5次后將樹脂裝入直徑5.5 cm、高100 cm的層析柱并連入AKATA蛋白純化儀(GE，美國)，檢測A280信號峰；用純水以流速5 mL/min洗滌直至電導率接近于0；用70%乙醇以流速5 mL/min洗脫，收集洗脫峰，Lowry法檢測肽類濃度；洗脫組分旋轉蒸發除乙醇，冷凍干燥，稱量.以10 mmol/L PBS(pH 7.4)配制500 μg/mL粗提物溶液用于細胞活性檢測.

1.5腫瘤細胞顯微觀察

C6神經膠質瘤細胞、A2780-CP卵巢癌順鉑耐藥細胞和HepG2肝癌細胞由廈門市中山醫院贈送.細胞培養液為含10%(體積分數)小牛血清的DMEM細胞培養液(Gibco)，細胞置于5%(體積分數)CO2培養箱內37 ℃培養，每2～3 d傳代一次.細胞活性檢測：向180 μL的對數生長期細胞中加入20 μL粗提物溶液或負對照(10 mmol/L pH 7.4的PBS)，培養12 h后在倒置顯微鏡(Leica DMil)下觀察細胞形態變化.

2結果

2.14種大孔吸附樹脂對海綿水溶性肽類的靜態吸附-解吸附效率

海綿水提液超濾后的體積很大，如何高效地對樣品濃縮和脫鹽成為首要任務.為提高水溶性活性組分的綜合回收效率，本實驗以肽類為檢測指標，測試了4種不同大孔吸附樹脂對肽類的靜態吸附率和解吸附率，結果如圖1所示.其中DA201-C對肽類在靜態吸附率、解吸附率和吸附穩定性上有明顯的綜合優勢.以吸附2 h為例，DA201-C具有最高的靜態吸附率(約68%)和最高的解吸附率(約63%)，其綜合回收效率約43%，高于AB-8(約32%)、D101(約23%)和NKA-9(約8%)；且DA201-C大孔吸附樹脂對肽類吸附2 h后達到吸附平臺，之后吸附率保持穩定.由此可見，DA201-C大孔吸附樹脂對肽類有綜合回收效率高和吸附穩定的特點，適用于完成較大規模的吸附實驗.

圖1　4種大孔吸附樹脂對海綿水溶性 肽類的靜態吸附率(a)和靜態解吸附率(b)Fig.1The adsorption (a) and desorption (b) properties of four macroporous resin types

2.2DA201-C大孔吸附樹脂的洗脫曲線

組分1與DA201-C大孔吸附樹脂攪拌混合過夜后，將吸附了肽類的樹脂裝入層析系統，洗脫曲線如圖2所示.共收集得到2～5 L區間的約3 L淺黃色解吸液，Lowry法測得其中含肽類總質量約8.01 g.解吸液旋轉蒸發，冷凍干燥得9.01 g粗提物干粉.

2.3水溶性肽類在提取流程各階段的得率

葉片山海綿在不同提取階段的得率見表1.本流程的出膏率約為2.4%，即從1 kg干質量的海綿能獲得大約24 g的粗提物，此粗提物主要成分為小分子肽類，占比約為89%.

檢測波長280 nm.圖2　DA201-C型大孔樹脂對肽類的動態解吸曲線Fig.2The dynamic desorption curve of DA201-C macroporous resin

2.4粗提物對腫瘤細胞活性的抑制作用

將粗提物以50 μg/mL的終質量濃度加入到C6、A2780-CP和HepG2 3種腫瘤細胞中，并在12 h后于倒置顯微鏡下觀察，結果如圖3所示.PBS對照組的C6細胞呈梭形，貼壁生長，胞質豐富且透明，細胞核相

表1　肽類在不同提取階段的得率Tab.1　Yields of peptides at different extraction stages

對較大，細胞間黏連完好，單層排列密集；經過粗提物處理的C6細胞呈圓形，細胞數量明顯減少，細胞發生皺縮，胞漿出現“發芽”結構，其體積明顯減小，細胞間連接變少(圖3(a)和(b)).PBS對照組的A2780-CP細胞呈團狀貼壁生長，細胞黏連較好，細胞體積較大，胞質豐富且均勻；而經過粗提物處理后的A2780-CP細胞體積顯著減小，細胞核固縮明顯，胞漿出現許多大小不一的空泡結構，細胞連接較少，數量也顯著地減少(圖3(c)和(d)).PBS對照組的HepG2細胞為梭形，貼壁生長，大小較一致;而經粗提物處理后的HepG2細胞變圓，細胞核等結構發生明顯的偏移，均集中在細胞的一側，而細胞膜完整(圖3(e)和(f)).由此可見，海綿的肽類粗提物對C6、A2780-CP和HepG2細胞的形態結構影響顯著，且細胞數量減少，證明該粗提物可以抑制這3種腫瘤細胞的生長，有明顯的抗腫瘤活性.

對照組：(a)C6細胞，(c)A2780-CP細胞，(e)HepG2細胞； 粗提物處理組(12 h)：(b)C6細胞， (d)A2780-CP細胞，(f)HepG2細胞.圖3　葉片山海綿粗提物處理后腫瘤細胞的顯微形態變化Fig.3Morphological changes of tumor cells by treatment with sponge extracts

3討論

肽類具有分子質量小、無免疫原性、結構簡單和副作用小等特點，具有很高的開發價值.海綿也擁有豐富的肽類或其衍生的活性產物，比如海綿來源的三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能誘導有絲分裂阻滯和細胞凋亡，具有良好的開發為抗癌藥物的潛力[6]；從蒂殼海綿屬Theonellasp.中分離得到雙環肽類Theonellamide A～F，有強烈的抗真菌活性[7].但是已發現的海綿活性肽類主要是通過有機萃取獲得的，通常與其他類別的化合物混雜在一起，目前還沒有一個系統富集海綿肽類的方法，肽的種類、分離效率和規模受到限制.建立一種系統富集小分子肽類的方法是本研究的關注點.

本方法首先通過超濾去除大分子，再利用大孔吸附樹脂富集水溶性小分子肽類.小分子肽類的提取難點在于脫鹽，許多寡肽和環肽的相對分子質量小于1 000，很難與水溶液中的鹽類分開.前期試驗了凝膠過濾、納濾、固相萃取和離子交換等方法脫鹽，但這些方法由于通量低、成本高、耗時長或吸附率低等原因，對升以上規模的操作困難極大.多個文獻報道了大孔吸附樹脂對某些肽類有良好的吸附特性[8-10]，可以應用于肽類水溶液的脫鹽.但由于肽類結構繁多，理化性質多樣，特定樹脂并不能把水溶液中的所有不同種類的肽類都吸附下來.本研究先測定了4種適用于肽類吸附的大孔吸附樹脂對海綿水提液肽類的靜態吸附率和解吸附率，確定了DA201-C大孔吸附樹脂具有最高的綜合回收效率；再通過動態解吸附，對水提液中肽類的總回收效率達到57%.整個脫鹽流程耗時僅1 d，具有成本低、耗時少、通量高和易放大等優點.

粗提物對3種腫瘤細胞明顯的抑制作用表明了本研究的提取方法有效地保留了小分子肽類的生物活性.雖然粗提物的細胞毒活性濃度處于中等水平，但通過進一步的分離純化，有望追蹤獲得活性更高的組分；而且通過更廣泛的活性篩選，比如抗氧化、抗菌和抗病毒等活性篩選模型，很可能會從中發現新的活性.優化的小分子肽類富集方法為后續的小分子肽類活性研究，包括更廣泛的活性篩選、活性組分的精細分離、結構測定和活性機理研究等工作奠定了堅實的基礎.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201508019

收稿日期：2015-08-26錄用日期：2015-11-16

基金項目：廈門南方海洋研究中心項目(13GYY002NF07)

*通信作者：chenjun@xmu.edu.cn

中圖分類號:P 745

文獻標志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)04-0506-04

The Enrichment Product from Sponge Mycale phyllophila Water Extract by a Macroporous Resin and Its Anti-tumor Activity

HE Tenfei1，LUO Lianzhong2，CHEN Jun1*，WANG Dexiang1，DING Shaoxiong1

(1.College of Ocean & Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China;2.Department of Pharmacy,Xiamen Medical College，Xiaman 361005，China)

Abstract:Marine sponges contain abundant bioactive compounds.This study established a method that a DA201-C macroporous adsorption resin was used to enrich bioactive products from Mycale phyllophila water extract.Lowry′s assay showed that this method recovered about 57% of the total small molecular peptides from the water extract.The majority compounds of the enrichment product are peptides，accounting for about 89%.In addition，the enriched product has obvious inhibitory activities to C6 glioma cells，A2780-CP ovarian cancer cisplatin-resistant cells and HepG2 hepatoma cells.This study lays the foundation for in-depth study on the anti-tumor compound from M. phyllophila water extract.

Key words:marine sponge;macroporous adsorption resin;peptide;anti-tumor activity

引文格式：賀騰飛，羅聯忠，陳軍，等.葉片山海綿水溶性活性產物的大孔吸附樹脂分離及其抗腫瘤活性[J].廈門大學學報(自然科學版)，2016,55(4)：506-509.

Citation：HE T F，LUO L Z，CHEN J,et al．The enrichment product from spongeMycalephyllophilawater extract by a macroporous resin and its anti-tumor activity[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：506-509．(in Chinese)