散發性乳腺癌中Ezrin和β?catenin蛋白表達的相關性和臨床意義

趙琳，于兆進，何苗，孫明立，魏敏杰

（中國醫科大學藥學院藥理教研室，沈陽 110122）

·論著·

散發性乳腺癌中Ezrin和β?catenin蛋白表達的相關性和臨床意義

趙琳，于兆進，何苗，孫明立，魏敏杰

（中國醫科大學藥學院藥理教研室，沈陽 110122）

目的埃茲蛋白（Ezrin）和β?連環蛋白（β?catenin）的作用與惡性腫瘤的侵襲轉移密切相關，本研究旨在探討二者在乳腺癌中的臨床意義。方法 應用免疫組織化學染色法檢測145例乳腺癌病理組織中Ezrin和β?catenin蛋白的表達水平，并分析二者相關性及其與乳腺癌臨床資料和預后資料的相關性。結果145例散發性乳腺癌組織中Ezrin陽性表達70例（48.3%），β?catenin陽性表達82例（56.6%），二者呈顯著負相關（r=-0.267，P=0.001）。乳腺癌組織學分級增高，Ezrin表達水平顯著升高（P=0.007），β?catenin表達水平顯著降低（P＜0.001）。發生淋巴結轉移的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P=0.027），β?catenin表達水平顯著降低（P=0.011）。Ezrin蛋白表達與乳腺癌患者總體生存期（P=0.004）及無病生存期（P=0.017）縮短顯著相關，β?catenin陽性表達則可顯著延長患者總體生存期（P＜0.001）及無病生存期（P=0.001）。但多變量Cox回歸發現，Ezrin 與β?catenin并非影響乳腺癌患者生存期的獨立風險因素。結論乳腺癌中Ezrin和β?catenin顯著負相關，且在乳腺癌轉移、惡化等病程進展及不良預后過程中發揮一定作用，可作為乳腺癌治療靶點。

乳腺癌；埃茲蛋白；β?連環蛋白；轉移；預后

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惡性腫瘤的侵襲轉移是造成其復發和不良預后的重要因素，因此對女性最常見的惡性腫瘤乳腺癌的侵襲轉移機制進行深入研究具有重要意義。埃茲蛋白（Ezrin）是膜-細胞骨架連接蛋白家族成員之一，在細胞的有絲分裂、增殖及細胞黏附、遷移等生物學行為中發揮重要作用［1?2］。在諸多腫瘤研究［3?4］中發現，Ezrin與腫瘤的侵襲轉移及不良預后有密切關系。β?連環蛋白（β?catenin）主要具有細胞間黏附連接功能，參與包括Wnt信號轉導通路在內的多種細胞信號轉導途徑，其功能異常與腫瘤侵襲轉移亦密切關系［5?6］。最近SAITO等［7］研究發現，通過RNA干擾技術下調舌鱗癌細胞株HSC?3的Ezrin表達水平，可造成β?catenin蛋白水平增加。但是在乳腺癌組織中同時檢測Ezrin和β?catenin蛋白表達，筆者查閱國內外文獻尚未見相關報道。本研究應用免疫組織化學染色法檢測145例乳腺癌病理組織中Ezrin和β?catenin蛋白的表達水平，并分析二者相關性及其與乳腺癌臨床資料和預后資料的相關性，以探討Ezrin和β?catenin在乳腺癌中的臨床意義。

1　材料與方法

1.1組織標本

本研究收集中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科病房2004年至2008年間收治的145例女性乳腺癌患者手術切取的乳腺組織，組織標本于-80℃冰凍保存備用。患者術前均未接受放療或化療，采用世界衛生組織標準進行組織學判定。

1.2免疫組織化學染色

冰凍組織經室溫解凍后，常規制作多聚甲醛固定、石蠟包埋組織塊，切4 μm厚組織切片，固定于防脫載玻片上制成組織切片。組織切片經脫蠟及水化后，進行高壓修復（80 kPa，10 min），然后用過氧化氫和正常山羊血清進行處理。滴加鼠抗人Ezrin單克隆抗體（ab4069，1∶100稀釋，美國Abcam公司）或兔抗人β?catenin單克隆抗體（ab32572，1∶100稀釋，美國Abcam公司）于4℃孵育過夜。次日，組織切片先后經生物素標記的二抗和鏈霉菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶（SP）復合物孵育，然后滴加DAB顯色。最后，組織切片經蘇木素復染、脫水、透明、封片后觀察。陰性對照以PBS代替Ezrin、β?catenin等抗體，其他步驟不變。

1.3免疫組織化學染色結果的評判

組織切片免疫組織化學染色結果由2位臨床病理醫生進行盲法評價。Ezrin表達于細胞質中，β?catenin表達于細胞膜中。細胞染色強度計分：無染色計為0，弱陽性計為1，中等強度計為2，強陽性計為3。染色細胞百分率（0～100%）與染色強度計分之積計為總分（0～300%）。采用受試者工作特征曲線分析以總分評判生存狀態的界值作為定義蛋白陰性表達和陽性表達的界值（圖1），結果顯示Ezrin 和β?catenin的界值分別為175%和167.5%。因此，定義總分＜175%為Ezrin陰性表達，總分≥175%為Ezrin陽性表達；定義總分＜167.5%為β?catenin陰性表達，總分≥167.5%為β?catenin陽性表達。

1.4統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。應用Spearman相關分析Ezrin與β?catenin蛋白表達的相關性，采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法分析Ezrin 和β?catenin蛋白表達水平與乳腺癌臨床資料的相關性，采用log?rank檢驗分析2組生存率的差異，采用Cox回歸進行多變量分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1病例的病理參數特征

圖1　　受試者工作特征曲線分析Ezrin和β?catenin免疫組化染色總分評判患者生存狀態的界值Fig.1　The receiver operating characteristic curve analysis with respect to survival state was used to determine the cutpoint of the immu?nohistochemical total score for Ezrin and β?catenin

本研究共收集145例散發性乳腺癌患者病理組織樣本，其中年齡≤50歲68例，＞50歲76例；絕經前患者72例，已絕經患者69例；病理診斷為導管癌118例，小葉癌17例；組織學分級Ⅰ級60例，Ⅱ～Ⅲ79例；TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期61例，Ⅲ期21例；發生淋巴結轉移61例，無淋巴結轉移84例。對145例患者進行隨訪以獲得生存資料，隨訪時間9～118個月，患者5年生存率為69.0%，患者總體生存期（overall survival，OS）平均為（96.9±2.7）個月，無病生存期（disease free survival，DFS）平均為（88.8±3.1）個月。

2.2乳腺癌組織中Ezrin與β?catenin蛋白表達及二者相關性

免疫組織化學檢測145例散發性乳腺癌組織中Ezrin與β?catenin蛋白表達（圖2），發現Ezrin陽性表達70例，陽性率為48.3%；β?catenin陽性表達82例，陽性率為56.6%。進一步分析二者表達相關性，發現二者呈顯著負相關（r=-0.267，P=0.001）。

2.3Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的相關性

圖2　　乳腺癌中Ezrin與β?catenin免疫組化染色的典型圖片 SP法×400Fig.2　Representative micrographs showing immunohistochemical staining of Ezrin and β?catenin in breast cancer tissues SP×400

采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法分析Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌患者臨床資料的相關性（表1），結果發現，與組織學分級Ⅰ級的組織相比，Ⅱ～Ⅲ級的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P= 0.007），β?catenin表達水平顯著降低（P＜0.001）；與未發生淋巴結轉移的組織相比，發生淋巴結轉移的乳腺癌組織Ezrin表達水平顯著升高（P=0.027），β?catenin表達水平顯著降低（P=0.011）。

2.4Ezrin與β?catenin蛋白表達對乳腺癌患者預后的影響

應用log?rank檢驗分析Ezrin與β?catenin蛋白表達水平對乳腺癌患者OS及DFS的影響（圖3），結果發現，Ezrin蛋白表達與乳腺癌患者OS（P=0.004）及DFS（P=0.017）縮短顯著相關（圖3A、3C），β?catenin陽性表達則可顯著延長患者OS（P＜0.001）及DFS （P=0.001，圖3B、3D）。

引入年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期、Ezrin蛋白表達、β?catenin蛋白表達等因素，進行多變量Cox回歸分析（表2），結果發現，腫瘤大小（OS，P=0.008；DFS，P=0.002）、組織學分級（OS，P=0.002；DFS，P=0.006）、TNM分期（OS，P= 0.008；DFS，P=0.006）為影響預后的獨立風險因素。此外，淋巴結轉移是影響患者DFS的獨立風險因素（P=0.002）。而Ezrin、β?catenin蛋白表達不是影響乳腺癌預后的獨立風險因素。

3　討論

Ezrin和β?catenin是參與調解腫瘤侵襲轉移的2個重要蛋白。本研究通過免疫組織化學染色法檢測了145例散發性乳腺癌中Ezrin和β?catenin蛋白表達水平，發現二者呈顯著負相關。相關的研究報道中，如SAITO［7］在舌鱗癌細胞中發現，通過下調Ezrin表達可導致β?catenin蛋白水平增加；而國內胡雪梅［8］對卵巢癌組織的研究發現Ezrin表達與β?catenin呈正相關，與本研究相悖。這可能是由于卵巢組織與乳腺組織的特異性所致，或者對β?catenin表達部位限定的差異造成。胡雪梅考察了細胞膜和細胞質中的β?catenin表達，而本研究只考察了細胞膜上正常的β?catenin表達，未考察細胞質和細胞核中的異常表達。

分析Ezrin和β?catenin與乳腺癌臨床資料及生存資料的相關性，發現Ezrin表達與較高的組織學分級和淋巴結轉移正相關，而β?catenin則與之負相關；且Ezrin與生存期縮短相關，β?catenin與生存期延長相關。這與已有的Ezrin的相關報道結果一致［3?4］。在已有的β?catenin的相關報道［9?11］中，β?catenin異常表達（非細胞膜位置）將失去介導細胞間鏈接、黏附的功能，并引起某些癌基因的轉錄，導致細胞癌變、轉移；并且MEI等［12］應用meta分析，發現β?catenin表達水平下降可導致非小細胞肺癌患者預后不良。可見，在乳腺癌中Ezrin促進細胞惡化及侵襲轉移和不良預后，而β?catenin則相反。但Ezrin和β?catenin并不是影響乳腺癌患者生存期的獨立風險因素，這可能是因為二者的作用與淋巴結轉移有關，進而影響預后，而非直接作用。

表1　Ezrin和β?catenin蛋白表達與乳腺癌患者臨床資料的相關性Tab.1　Association of Ezrin and β?catenin expression with clinicopathological features of breast cancer

圖3　Ezrin與β?catenin蛋白表達對乳腺癌患者預后的影響Fig.3　Analysis of the prognostic significance of Ezrin and β?catenin in breast cancer patients

綜上所述，筆者認為，在乳腺癌轉移、惡化等病程進展及不良預后過程中，Ezrin和β?catenin均發揮了一定作用，且二者密切相關，因此Ezrin和β?catenin可作為乳腺癌治療方案的作用靶點。

［1］ALGRAIN M，TURUNEN O，VAHERI A，et al.Ezrin contains cyto?skeleton and membrane binding domains accounting for its pro?posed role as a membrane?cytoskeletal linker［J］.J Cell Biol，1993，120（1）：129-139.DOI：10.1083/jcb.120.1.129.

［2］HANZEL D，REGGIO H，BRETSCHER A，et al.The secretion?stim?ulated 80K phosphoprotein of parietal cells is ezrin，and has proper?ties of a membrane cytoskeletal linker in the induced apical micro?villi［J］.EMBO J，1991，10（9）：2363-2373.

［3］HUNTER KW.Ezrin，a key component in tumor metastasis［J］. Trends Mol Med，2004，10（5）：201-204.DOI：10.1016/j.molmed. 2004.03.001.

［4］KHANNA C，WAN X，BOSE S，et al.The membrane cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis［J］.Nat Med，2004，10（2）：182-186.DOI：10.1038/nm982.

［5］KARATZAS G，KARAYIANNAKIS AJ，SYRIGOS KN，et al.Ex?pression patterns of the E?cadherin?catenin cell?cell adhesion com?plex in gastric cancer［J］.Hepatogastroenterology，2000，47（35）：1465-1469.

［6］KASE S，SUGIO K，YAMAZAKI K，et al.Expression of E?cadherin and beta?catenin in human non?small cell lung cancer and the clini?cal significance［J］.Clin Cancer Res，2000，6（12）：4789-4796.

［7］SAITO S，YAMAMOTO H，MUKAISHO K，et al.Mechanisms un?derlying cancer progression caused by ezrin overexpression in tongue squamous cell carcinoma［J］.PLoS One，2013，8（1）：e54881.DOI：10.1371/journal.pone.0054881.

［8］胡雪梅，張繼學，王瑞軍，等.Ezrin、E?cadherin和β?catenin在卵巢癌組織中的表達及臨床意義［J］.蘭州大學學報（醫學版），2010，36（1）：31-34.DOI：10.3969/j.issn.1000?2812.2010.01.009.

［9］LUSTIG B，BEHRENS J.The Wnt signaling pathway and its role in tumor development［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2003，129（4）：199-221.

［10］NELSON WJ，NUSSE R.Convergence of Wnt，β?catenin，and cad?herin pathways［J］.Science，2004，303（5663）：1483-1487.DOI：10.1126/science.1094291.

［11］MOON RT，KOHN AD，DE FERRARI GV，et al.Wnt and β?catenin signaling：diseases and therapies［J］.Nat Rev Genet，2004，5（9）：689-699.DOI：10.1038/nrg1427.

［12］MEI XD，SU H，SONG J，et al.Prognostic significance of β?catenin expression in patients with non?small cell lung cancer：a meta?analysis［J］.Biosci Trends，2013，7（1）：42-49.DOI：10.5582/ bst.2013.v7.1.42.

表2　　多變量Cox回歸分析乳腺癌臨床病理參數對患者生存期的影響Tab.2　Multivariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in breast cancer

（編輯陳姜）

Correlation and Clinical Significance of Ezrin and β?catenin Protein Expression in Sporadic Breast Cancer

ZHAO Lin，YU Zhaojin，HE Miao，SUN Mingli，WEI Minjie
（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of Ezrin and β?catenin in breast cancer.MethodsImmunohistochemical staining method was adopted to detect Ezrin and β?catenin protein expression level in 145 cases of breast cancer tissues，and their correlation with clinical data and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsEzrin was expressed in 70 cases（48.3%），β?catenin was expressed in 82 cases （56.6%），and there was significantly negative correlation（r=0.267，P=0.001）.The higher histologic grade of breast cancer，the higher expres?sion level of Ezrin（P=0.007），and the lower expression level of β?catenin（P＜0.001）.Ezrin expression level was increased significantly（P= 0.027），but β?catenin expression level was reduced significantly（P=0.011）in lymph node positive breast cancer tissue.Ezrin expression was sig?nificantly correlated with shorter overall survival（P=0.004）and disease free survival（P=0.017）of breast cancer patients，but β?catenin expres?sion was significantly correlated with longer overall survival（P＜0.001）and disease free survival（P=0.001）of breast cancer patients.However，Ezrin and β?catenin were not the independent risk factors of breast cancer patients as determined by multivariate Cox regression.ConclusionEz?rin was significantly negative correlated with β?catenin in breast cancer.They play a role in the progression and poor prognosis of breast cancer，which can be used as breast cancer treatment targets.

breast cancer；Ezrin；β?catenin；metastasis；prognosis

R73?3

A

0258-4646（2016）08-0673-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.001

國家自然科學基金（81373427）；遼寧省科學技術計劃本溪生物醫藥產業集群項目（2014226033）；遼寧省高等學校創新團隊項目（LT2014016）

趙琳（1979-），女，副教授，博士.

魏敏杰，E-mail：weiminjiecmu@163.com

2015-12-09
網絡出版時間：