TBX1基因在透明細胞型腎細胞癌組織中的表達及意義

姜紅堃，田紅宇，郭燕平，王妍，張宇曦，姜紅

（中國醫科大學附屬第一醫院1.兒科；2.病理科；3.泌尿外科，沈陽 110001）

TBX1基因在透明細胞型腎細胞癌組織中的表達及意義

姜紅堃1，田紅宇1，郭燕平1，王妍2，張宇曦3，姜紅1

（中國醫科大學附屬第一醫院1.兒科；2.病理科；3.泌尿外科，沈陽 110001）

目的通過檢測TBX1基因在透明細胞型腎細胞癌（ccRCC）癌組織中的表達，探討該基因在ccRCC發病中的分子遺傳學機制。方法應用實時定量聚合酶鏈反應（qRT?PCR）法檢測12例ccRCC癌組織及對應的癌旁正常腎組織中TBX1mRNA表達；Western blot法檢測腎組織TBX1蛋白表達。結果與癌旁正常腎組織比較，TBX1mRNA及蛋白表達水平在ccRCC癌組織中均明顯增強（均P＜0.05）。結論TBX1基因過度表達可能為ccRCC發生的一種潛在致病機制。

TBX1基因；透明細胞型腎細胞癌；實時定量聚合酶鏈反應；Western blot

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KeywordsTBX1；clear cell renal cell carcinoma；RT?PCR；Western blot

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）起源于腎小管上皮細胞［1?2］，是腎臟最常見的實體瘤，約占全部腎臟惡性腫瘤的90%。很多RCC直至疾病晚期才出現癥狀，而放療、化療及生物學治療效果均不理想，統計數據［3］顯示RCC術后的復發和轉移率高達40%。因此早期診斷和治療對于改善患者的預后非常重要。RCC包括幾種不同的具有特定組織病理學和基因特征的亞型，透明細胞型腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為RCC最常見的病理類型，占75%～85%［3］。其具體病因尚不明確，有研究［4］證實遺傳因素為高危因素之一。人類TBX1基因定位于22q 11.21，是染色體22q11.2微缺失綜合征（主要為DiGeorge綜合征及腭心面綜合征）中的重要基因［5］。研究［6］表明TBX1基因在小鼠胚胎腎臟發育過程中的表達水平呈波動趨勢，在腎臟發育成熟后僅微量表達，該基因可能通過Smad通路參與腎臟發育。本研究利用實時定量聚合酶鏈反應（real?time quantitative polymerase chain reac?tion，qRT?PCR）法、Western blot法檢測ccRCC癌組織和對應的癌旁正常腎組織中TBX1基因的表達，以明確該基因在ccRCC發生、發展中的分子遺傳學機制，為ccRCC的早期診斷提供理論依據。

1　　材料與方法

1.1臨床資料及標本留取

本研究的標本來源及使用受試對象均知情并簽字同意，并經由學院學術倫理委員會討論批準。本實驗所留取的12例ccRCC腫瘤組織及癌旁正常腎組織（距腫瘤邊緣≥3 cm）標本來源于本院及中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科2011年10月至2012年9月期間行根治性腎癌切除術的患者，男8例，女4例，年齡23～78歲，平均（53.1±15.2）歲。按所留取標本經病理診斷確定腫瘤病理類型為ccRCC。按照Fuhrman核分級系統分級［7］，高分化7例，中分化2例，低分化3例。依據2010年AJCC腎癌的TNM分期標準，Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例，Ⅳ期2例。將切除的新鮮組織置于經焦炭酸二乙醋（pyro carbonic acid diethyl ester，DEPC）處理過的EP管中后，迅速轉移至-80℃冰箱保存待檢。

1.2qRT?PCR檢測TBX1mRNA表達

1.2.1引物設計與合成：使用Primer5.0軟件設計TBX1基因及β?actin基因序列特異性引物由上海生工生物工程公司合成。TBX1引物，上游5′TAGC GAGAAATATGCCGAGGA 3′，下游5′CGTGATCC GATGGTTCTGGT 3′，產物長度94 bp。β?actin引物，上游5′CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3′，下游5′GCTG TC ACCTTCACCGTTCC 3′，產物長度268 bp。

1.2.2提取總RNA及反轉錄反應：按照Trizol RNA抽提試劑盒（美國Invitrogen公司）使用說明書提取總RNA。檢測260 nm和280 nm波長的光密度，紫外分光光度儀掃描后，根據A260/280比值檢測RNA濃度。立即將提取的RNA進行反轉錄或轉移至-80℃冰箱保存備用。參照TaKaRa反轉錄試劑盒（大連寶生物有限責任公司）使用說明將總RNA反轉錄為cDNA，反應條件：42℃60 min，99℃5 min，4℃5 min，總體積為20 μL。所得cDNA于-20℃冰箱凍存備用。

1.2.3PCR：依據SYBR Green PCR Master mix染料法說明書（美國Applied Biosystems公司），以反轉錄所得cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為，2× SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL；cDNA 0.5 μL；引物各1.0 μL；ddH2O 11.0 μL。置于熒光定量實時PCR儀（美國Applied Biosystems公司，7900型）進行擴增，擴增條件，60°C 2 min→93°C 10 min→90° C 15 s→53°C 1 min，循環40次。PCR擴增產物結果顯示，標準曲線具良好的線性關系，熔解曲線均具單一特異峰，表明擴增產物具特異性。以β?actin為內參，校正所得擴增樣本Ct值。將腎細胞癌組織基因值與癌旁正常腎組織基因值進行比值計算。

1.3Western blot檢測

1.3.1腫瘤組織及癌旁組織總蛋白的提取：切取約100 mg腫瘤組織和癌旁組織，研磨至粉末狀，加入蛋白裂解液1 mL，將組織置于干冰上，在超聲波粉碎機下粉碎，電動勻漿，于4°C下12 000g離心15 min，吸取上清液為樣品；蛋白抽提試劑盒購自美國Active Motif公司。利用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

1.3.2電泳、轉膜：制備出十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）電泳凝膠，并將其加樣于40 μg抽提的蛋白溶解物中電泳4 h，然后轉至硝酸纖維素膜（美國Amersham公司）。

1.3.3雜交及顯色：取下硝酸纖維素膜，TBS浸泡10 min，50 g/L脫脂奶封閉1 h，TBS洗2次，5 min/次，加入一抗（山羊源性TBX1或β?actin抗體，稀釋度為1∶300，美國Abcam公司），室溫孵育2 h。TBST洗滌2次，5 min/次，加入二抗（兔抗羊IgG抗體，稀釋度為1∶2 000，美國Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗滌2次，每次5 min。利用ECL顯色試劑（美國Amersham公司）顯影曝光，凝膠圖像掃描儀（美國Gene公司）定量分析。

1.4統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。所得數據均以±s表示。采用t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　　結果

2.1qRT?PCR實驗結果

與癌旁正常腎組織（1.00±0.01）比較，ccRCC癌組織（1.825±0.216）TBX1mRNA表達水平明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2Western blot檢測結果

各條帶灰度值分析結果表明，ccRCC癌組織（2.27±0.26）TBX1蛋白表達較癌旁正常腎組織（1.00±0.27）增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1　Western blot法檢測ccRCC癌組織及癌旁正常腎組織TBX1蛋白的表達Fig.1　Detection of TBXl protein expression in renal cell carcino?ma tissues and normal kidney tissues adjacent to carci?noma by Western blot

3　　討論

T?box家族各成員共享一個獨特的DNA結構域，該家族基因編碼的轉錄因子為胚胎發育所必需，參與調控胚胎發育多種進程［8］。作為T?box家族成員，該基因主要調控第二心區細胞的增殖及分化，是導致心臟流出道異常的先天性心臟病的主要基因。此外該基因參與牙齒、耳、甲狀旁腺及胸腺等多種組織和器官的發育，在精神疾病的發病中亦扮演一定角色［9?15］。目前關于TBX1基因的研究多圍繞該基因與胚胎期心臟發育及先天性心臟發育異常進行，而關于此基因與胚胎期腎臟發育及腎臟相關疾病的研究較少。FU等［6］研究表明，TBX1基因在胚鼠腎臟發育過程中表達水平呈波動趨勢，作為轉錄因子TBX1可與HOXD10相互作用，通過激活Smad通路參與腎臟發育過程；TBX1基因在腎臟發育成熟后僅微量表達。本課題組前期研究［16］發現，在慶大霉素誘導的急性腎小管損傷模型鼠中TBX1基因被再激活，并通過TGF?β?Smad2/3途徑參與腎小管的損傷修復過程。

腎細胞癌具有遺傳性和散發性兩種發病形式，研究表明3號染色體短臂缺失為透明細胞腎細胞癌中最常見的染色體畸變；BHD基因是腎細胞癌的易感基因，為抑癌基因，其編碼的蛋白產物為follicu?lin，該蛋白在正常腎組織中表達，其功能喪失可能為多種病理類型腎細胞癌發病的共同基礎；此外研究證實MET基因、FH基因及XP11.2易位/TFE3融合基因等均可能參與腎細胞癌的發生發展。IGA?RASHI［17］在對腎細胞癌及多種腫瘤細胞系的研究表明，PAX2基因在腎細胞癌中呈特異性表達且有增高趨勢，為原發及轉移的RCC的特異性標志物。該基因在腎臟發育過程中參與前、中、后腎的發育，其表達失衡可導致多囊腎、先天性腎病綜合征等先天性腎發育異常［18］。該基因亦為腎臟間質-上皮轉化的關鍵因子，其高表達可促進細胞增殖，從而導致腎臟腫瘤的發生。研究證實PAX2基因表達異常與泌尿生殖系統惡性腫瘤的發生密切相關［19］。課題組前期研究發現，PAX2作為轉錄因子可直接與TBX1基因上游的轉錄調控區結合，正向調節TBX1基因的表達，可能在腎臟發育及腎臟疾病發生過程中扮演重要角色［20］。本研究采用qRT?PCR法及Western blot法檢測ccRCC腫瘤組織TBX1mRNA及蛋白表達，結果顯示與癌旁正常腎組織比較，ccRCC癌組織TBX1mRNA及蛋白表達均顯著增強（P＜ 0.05）。由此推測，在ccRCC的發生過程中，PAX2基因過度表達，導致其下游TBX1基因表達增強，激活某一通路，促使腎小管上皮細胞增殖，從而導致腫瘤的發生。然而關于TBX1基因究竟通過何種途徑參與ccRCC的發生發展尚待深入探討。

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（編輯武玉欣）

Expression of TBX1 Gene in Kidney Tissues in Patients with Clear Cell Renal Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

JIANG Hongkun1，TIAN Hongyu1，GUO Yanping1，WANG Yan2，ZHANG Yuxi3，JIANG Hong1
（1.Department of Pediatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pathology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Urological Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo analyze the expression ofTBX1gene in kidney tissues in patients with clear cell renal cell carcinoma（ccRCC）and in?vestigate its molecular genetics mechanism during the tumor development.MethodsReal?time quantitative polymerase chain reaction（qRT?PCR）was used to detect the expression ofTBX1mRNA in 12 cases of clear cell renal cell carcinoma tissues and the corresponding normal kidney tissues adjacent to carcinoma.The protein expression of TBX1 was assayed by Western blot in both groups.ResultsBothTBX1mRNA level and the protein level were significantly up?regulated in ccRCC tissues compare to those in normal kidney tissues adjacent to carcinoma（allP＜0.05）.ConclusionOver?expression ofTBX1gene might be a potentially pathogenic mechanism of ccRCC.

R737.11

A

0258-4646（2016）08-0692-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.005

國家自然科學基金（81300130）；教育部高校博士點專項基金（20122104110001）；遼寧省省直醫院改革重點臨床科室診療能力建設項目（LNCCC?D06?2015）

姜紅堃（1974-），女，副教授，博士. E-mail：jianghongkun007@163.com

2015-11-29
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