NK?1受體在截斷尾末端小鼠扣帶回前部神經元Fos蛋白表達中的作用

張雅娟，吳敏范，吳孟霏，楊宇，商麗宏，王兵，潘建

（1.沈陽市第五人民醫院神經內科，沈陽 110023；2.沈陽醫學院生理學教研室，沈陽 110034；3.遼寧何氏醫學院2014級藥學專業，沈陽 110163）

NK?1受體在截斷尾末端小鼠扣帶回前部神經元Fos蛋白表達中的作用

張雅娟1，吳敏范2，吳孟霏3，楊宇2，商麗宏2，王兵1，潘建1

（1.沈陽市第五人民醫院神經內科，沈陽 110023；2.沈陽醫學院生理學教研室，沈陽 110034；3.遼寧何氏醫學院2014級藥學專業，沈陽 110163）

目的研究截斷尾末端能否引起小鼠扣帶回前部（ACC）神經元Fos蛋白表達的改變，以及NK?1受體在該變化中的作用。方法用免疫組化技術研究截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.25 h、0.5 h、1 h和2 h ACC神經元Fos蛋白表達的變化，以及GR82334 NK?1受體拮抗劑尾靜脈、蛛網膜下腔注射對該變化的影響。結果截斷小鼠尾末端后0.25 h和0.5 h ACC神經元Fos蛋白表達顯著增加，1 h達高峰，2 h后開始消退；GR82334尾靜脈注射完全拮抗了截斷小鼠尾末端引起的ACC神經元Fos蛋白表達的顯著增加，但GR82334蛛網膜下腔注射拮抗作用不完全。結論截斷小鼠尾末端能夠引起ACC神經元Fos蛋白表達呈時間依賴性顯著增加；外周與中樞NK?1受體參與此過程，但是，尚存其他受體和遞質參與的中樞傳導通路引起ACC神經元Fos蛋白表達的顯著增加。

扣帶回前部；幻肢痛；Fos蛋白；免疫組化；NK?1受體

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60%～80%的截肢患者術后伴有幻肢痛（phan?tom limb pain，PLP）［1?2］。有研究［3?4］報道，扣帶回前部（anterior cingulate cortex，ACC）是重要的痛覺中樞，PLP患者的ACC神經元活動發生明顯改變［5］，截肢大鼠ACC對外周刺激及中樞刺激反應增強［6］，截斷小鼠尾末端常用于研究PLP產生的中樞機制［7］。目前，PLP發病機理仍不清楚。研究［8-9］表明，即刻早基因（c?fos）及Fos蛋白的表達標志著傷害性感受神經元興奮，速激肽NK?1受體參與傷害性電刺激大鼠隱神經引起的ACC神經元Fos蛋白表達顯著增高的過程。但是，截斷小鼠尾末端能否引起ACC神經元Fos蛋白表達的改變及速激肽NK?1受體是否參與該過程尚未見報道。因此，本研究應用免疫組織化學技術對此進行探討，以期闡明速激肽NK?1受體在傷害性信息傳遞和調制中的作用，深入研究PLP的產生機理，為臨床治療PLP提供科學實驗依據。

1　　材料與方法

1.1實驗動物分組

昆明種成年小鼠54只，雌性，體質量（27±6）g，沈陽醫學院實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK遼2010?0001）。將小鼠行1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg·kg-1），隨機將小鼠均分為9組：空白對照組；用剪刀截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.25 h、0.5 h、1 h、2 h實驗組（即斷尾后0.25 h組、0.5 h組、1 h組、2 h組）；1%GR82334尾靜脈注射（1 mg·kg-1）后10 min，截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h實驗組（即GR82334 iv組）；與GR82334 iv組同體積生理鹽水尾靜脈注射后10 min，截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h對照組（即NS iv組）；GR82334蛛網膜下腔注射（10 μg·10 μL-1）后10 min，截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h實驗組（即GR82334 ith組）；與GR82334 ith組同體積生理鹽水蛛網膜下腔注射后10 min，截斷小鼠尾末端2.5 cm后0.5 h對照組（即NS ith組）。

1.2小鼠ACC Fos蛋白表達檢測

將上述各組小鼠迅速斷頭，在冰臺上取腦，置入4℃，4%多聚甲醛中過夜固定。連續冠狀-20℃冰凍切片的厚度為15 μm，用免疫組化方法常規染片及洗片等，最后用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀（×400）檢測切片ACC的陽性細胞積分光密度和面積百分比。

1.3統計學分析

2　　結果

2.1截斷尾末端后不同時間小鼠ACC神經元的Fos蛋白表達

與空白對照組比較，截斷尾末端后0.25 h，ACC神經元的Fos蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；截斷尾末端后0.5 h，ACC神經元的Fos蛋白表達進一步增加（P＜0.01）；截斷尾末端后1 h，ACC神經元的Fos蛋白表達達到高峰（P＜0.01）；截斷尾末端后2 h，ACC神經元的Fos蛋白表達開始消退，但是，仍然高于空白對照組（P＜0.05，圖1）。該結果提示，截斷小鼠尾末端能夠引起ACC神經元的Fos蛋白表達呈時間依賴性顯著增加。

圖1　截斷尾末端后不同時間小鼠ACC神經元的Fos蛋白表達Fig.1　Fos protein expression in mice ACC neurons at various time after amputation of the tail extremity

2.2蛛網膜下腔注射GR82334對截斷尾末端增加小鼠ACC神經元的Fos蛋白表達的影響

與空白對照組比較，截斷尾末端后0.5 h ACC Fos蛋白表達顯著增強，Fos蛋白表達積分光密度和陽性細胞面積百分比顯著增高（P＜0.01）；NK?1受體拮抗劑GR82334蛛網膜下腔注射10 min后再截斷尾末端0.5 h后，ACC Fos蛋白表達也顯著增強（P＜0.05），但是，ACC Fos蛋白表達增強的幅度明顯低于單純截斷尾末端0.5 h后ACC Fos蛋白表達增強的幅度（P＜0.05），也低于蛛網膜下腔注射同體積生理鹽水10 min再截斷尾末端后0.5 h引起的ACC Fos蛋白表達增強的幅度（P＜0.05），見圖2。

圖2　蛛網膜下腔注射GR82334對截斷尾末端增加ACC神經元的Fos蛋白表達的影響Fig.2　Effect of GR82334 intrathecal injection on increase in Fos protein expression in mice ACC neurons induced by amputation of the tail extremity

2.3尾靜脈注射GR82334對截斷尾末端小鼠ACC神經元的Fos蛋白表達的影響

與空白對照組相比較，截斷尾末端后0.5 h ACC Fos蛋白表達顯著增強，Fos蛋白表達積分光密度和陽性細胞面積百分比顯著增高（P＜0.01）；NK?1受體拮抗劑GR82334尾靜脈注射10 min再截斷尾末端后0.5 h，ACC Fos蛋白表達輕度增強，但是，Fos蛋白表達積分光密度和陽性細胞面積百分比無統計學差異（P＞0.05）。而同體積的生理鹽水尾靜脈注射10 min后再截斷尾末端后0.5 h引起ACC Fos蛋白表達顯著增強，Fos蛋白表達積分光密度和陽性細胞面積百分比有統計學差異（P＜0.01），見圖3。

圖3　尾靜脈注射GR82334對截斷尾末端增加ACC神經元的Fos蛋白表達的影響Fig.3　Effect of GR82334 caudal veins injection on increase in Fos protein expression in mice ACC neurons induced by amputation of the tail extremity

3　　討論

有研究［8］報道，Fos蛋白表達可作為中樞神經系統對刺激產生反應的疼痛標志物，標志著傷害性感受神經元興奮，表達Fos蛋白的部位常是與傷害性傳入信息傳遞、整合等有關的區域；截肢大鼠ACC神經元活動發生明顯改變［6］。但是，截斷小鼠尾末端能否引起ACC神經元Fos蛋白表達的改變尚未見報道。本研究觀察到在空白對照組ACC神經元有少量的Fos蛋白表達；截斷小鼠尾末端后0.25 h、0.5 h ACC神經元Fos蛋白表達顯著增加，1 h達高峰，2 h后開始消退。因此認為在正常情況下ACC神經元存有Fos蛋白較低水平的表達；ACC神經元能夠感受小鼠斷尾傳入的傷害性信息，引起Fos蛋白表達呈時間依賴性顯著增加，ACC神經元參與斷尾后中樞神經系統的可塑性變化。本研究結果為深入研究PLP提供了實驗依據。

PLP是截肢后常見并發癥之一。目前，關于PLP產生的原因仍不清楚，尚無理想的治療方法。速激肽NK?1受體與痛覺過敏等有關［10?11］。但是，截斷尾末端增加ACC神經元的Fos蛋白表達過程是否有NK?1受體參與尚未見報道。本研究結果發現，NK?1受體拮抗劑GR82334尾靜脈注射能夠拮抗截斷尾末端引起的ACC神經元Fos蛋白表達顯著增加，提示外周NK?1受體參與了截斷尾末端引起的ACC神經元Fos蛋白表達的顯著增加過程。由于GR82334不容易通過血腦屏障，因此進一步研究了GR82334蛛網膜下腔注射對截斷尾末端誘導ACC神經元Fos蛋白表達增加的影響。研究結果顯示，截斷尾末端誘導ACC神經元Fos蛋白表達增加可被GR82334蛛網膜下腔注射拮抗，提示中樞NK?1受體也參與截斷尾末端引起的ACC神經元Fos蛋白表達的顯著增加過程。但是，GR82334蛛網膜下腔注射沒有完全阻斷Fos蛋白表達的顯著增加，提示可能尚存其他受體和遞質參與中樞傳導通路引起ACC神經元Fos蛋白表達的顯著增加。斷尾后中樞神經系統的可塑性變化非常復雜，NK?1受體可能為治療PLP的潛在靶點之一。

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（編輯于溪）

Role of NK?1 Receptor in Fos Protein Expression of Anterior Cingulate Cortex Neurons of Mice Induced by Amputation of the Tail Extremity

ZHANG Yajuan1，WU Minfan2，WU Mengfei3，YANG Yu2，SHANG Lihong2，WANG Bing1，PAN Jian1
（1.Department of Neurology，The Fifth People′s Hospital of Shenyang City，Shenyang 110023，China；2.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Majoring in Pharmacy，Grade 2014，He University，Shenyang 110163，China）

ObjectiveTo study whether amputation of the tail extremity could induce change of Fos protein expression in mice ACC neurons，and explore the role of NK?1 receptor in the change.MethodsImmunohistochemistry technique was adopted to study Fos protein expression change in mice ACC neurons at 0.25 h，0.5 h，1 h，2 h after amputation of the tail extremity 2.5 cm，and also the effect of NK?1 receptor antagonist GR82334（iv）or GR82334（ith）in the change.ResultsFos protein expression in mice ACC neurons was significantly increased at 0.25 h，0.5 h after the amputation，and reached its peak at 1 h after the amputation，then started to decrease at 2 h after the amputation.GR82334（iv）com?pletely antagonized the significant augment in Fos protein expression in mice ACC neurons after the amputation，but the antagonism of GR82334 （ith）was incomplete.ConclusionAmputation of the tail extremity could significantly increase the Fos protein expression of mice ACC neurons in a time?dependent manner.Both peripheral and central NK?1 receptors were involved in the process.However，there are also central conduction pathways of other receptors and neurotransmitters involved in the significant augment in Fos protein expression in mice ACC neurons after amputa?tion.

anterior cingulate cortex；phantom limb pain；Fos protein；immunohistochemistry；NK?1 receptor

R338；Q432

A

0258-4646（2016）08-0700-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.007

遼寧省自然科學基金（L2015020391）；沈陽市科技攻關項目（F13?220?9?45）

張雅娟（1969-），女，主任醫師，碩士.

吳敏范，E-mail：minfanwu0594@sina.com.cn

2015-11-21
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