DEK 蛋白在膀胱尿路上皮癌癌組織和尿液中的表達及臨床意義

吳瓊，王貽兵，楊騰飛

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.涉外醫療服務中心；2.泌尿外科，沈陽 110004）

DEK 蛋白在膀胱尿路上皮癌癌組織和尿液中的表達及臨床意義

吳瓊1，王貽兵2，楊騰飛1

（中國醫科大學附屬盛京醫院1.涉外醫療服務中心；2.泌尿外科，沈陽 110004）

目的探究DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌癌組織和尿液中的表達及其與腫瘤病理分期之間的關系。方法應用免疫組化技術檢測48例膀胱尿路上皮癌組織和18例癌旁正常組織DEK蛋白的表達，應用蛋白免疫印跡的方法檢測28例膀胱尿路上皮癌患者和6例健康者（對照組）尿中的DEK蛋白的表達。結果膀胱尿路上皮癌癌組織中DEK蛋白的陽性表達率（73%）高于癌旁正常組織（33%，P＜0.05）；淺表性膀胱尿路上皮癌組織中DEK的陽性表達率（86%）高于浸潤性（55%，P＜0.05）；膀胱尿路上皮癌患者尿液中DEK相對表達量（0.834）明顯高于對照組（0.242，P＜0.05）；以對照組尿液中DEK的相對表達量作為標準，診斷膀胱尿路上皮癌的靈敏度可達82.1%。結論DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌患者癌組織和尿液中呈現陽性表達，與膀胱癌的病理分級有密切關系。癌癥早期DEK蛋白在組織中的陽性表達高于癌癥晚期。組織中和尿液中DEK表達認為是潛在的診斷膀胱尿路上皮癌的腫瘤標記物。

膀胱尿路上皮癌；DEK蛋白；癌組織；尿液

網絡出版地址

膀胱癌是常見的泌尿系惡性腫瘤之—，其發病率居我國惡性腫瘤第8位，并呈逐年增長趨勢，過去10年間平均增長率為4.6%。膀胱尿路上皮癌（也稱膀胱移行細胞癌）最為常見，占膀胱癌的90%以上［1］。膀胱尿路上皮癌術后易復發，復發后惡性程度高，浸潤能力強，目前傳統診斷方法是膀胱鏡檢和組織活檢，費用昂貴且患者痛苦。因此，尋找有效而無創的腫瘤標志物尤為重要［2?3］。本研究通過檢測膀胱尿路上皮癌患者癌組織和尿液中DEK蛋白的表達，探討DEK與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關系及其早期診斷價值。

1　　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本：選取2013年9月至2015年7月本院收治的48例膀胱尿路上皮癌患者的組織標本，所有患者術前未做化療，術后病理檢查確診為膀胱尿路上皮癌。所有受試者均于試驗前了解研究情況并簽署知情同意書。其中男31例，女17例，年齡46～85歲，年齡（65.62±7.82）歲，中位年齡65歲。根據2004年公布的WHO膀胱惡性腫瘤病理分級標準［4］，其中低度惡性傾向患者5例，低度惡性患者20例，高度惡性患者23例，研究將低度惡性傾向和低度惡性合計為低度惡性；按UICC TNM腫瘤分期標準，表淺性（Tis，Ta，T1）28例，肌層浸潤性（T2，T3，T4）20例。另選取18例距切除癌組織邊緣5 cm以上正常膀胱組織作為對照（術后病理證實無癌細胞浸潤），其中男12例，女6例，中位年齡66歲。

1.1.2患者和健康者尿液標本：收集膀胱尿路上皮癌組中28例患者術前24～48 h的中段晨尿（50 mL），尿樣收集后避光4℃保存。5 000g離心15 min后轉入塑料試管中，-80℃凍存。另外收集6例健康志愿者晨尿作為對照組備用。

1.2方法

1.2.1免疫組化SP法染色：所有石蠟標本均連續切片，組織切片使用二甲苯及乙醇常規脫蠟并水化，檸檬酸鹽抗原修復液中進行抗原修復，PBS漂洗2次；置入1.5%的H2O2去離子水中30 min，蒸餾水沖洗；正常血清37℃孵育15 min，加入一抗（DEK兔抗人多克隆抗體，Abcam公司，1∶100稀釋；空白對照中以PBS代替一抗），4℃冰箱孵育過夜；PBS液浸泡后加入二抗（生物素標記抗IgG抗體，北京中杉公司），37℃孵育60 min，DAB顯色30 min，滴加過氧化物酶標記鏈霉卵白素液（西安托克公司），37℃孵育20 min，蘇木素復染后中性樹膠封片。DEK陽性為細胞核著色，按染色強度和陽性表達細胞數比例判定結果，無表達為陰性（-）；著色細胞數≤50%或染色較淺為弱陽性（+）；著色細胞數＞50%且染色較深為強陽性（++），（+）和（++）均視為陽性表達。

1.2.2蛋白免疫印跡半定量檢測DEK蛋白：取20 mL尿液樣本加入-20℃預冷的丙酮沉淀蛋白質，離心后用細胞裂解液復溶蛋白，再次離心后保留上清。使用DEK兔多克隆抗體（Abcam公司）進行Western blot分析，通過凝膠成像分析系統檢測目的條帶和內參照的灰度對比，以DEK蛋白量/GAPDH蛋白量的比值為最終結果，分析比較患者和健康者尿液中DEK蛋白水平。由專業人員按試劑盒說明嚴格操作。

1.3統計學分析

用SPSS 19.0統計軟件處理實驗數據，DEK陽性表達與病理參數之間的關系采用Pearson chi?square檢驗或者Fisher確切概率法檢測；計量資料數據以±s表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　　結果

2.1DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中的表達

結果表明，膀胱尿路上皮癌組織和癌旁正常組織中DEK蛋白陽性表達率分別為72.92%（35/48）、33.33%（6/18），癌組織中DEK蛋白陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統計學意義（χ2=6.443，P=0.011）。

DEK蛋白的陽性表達率在低度惡性和高度惡性的腫瘤組織中分別為84.00%和60.90%，DEK的表達隨腫瘤惡性程度的增高而降低，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）；DEK在浸潤性癌組織中的表達為55%，低于表淺性癌（85.71%），兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）；DEK表達在不同性別及年齡患者中差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2DEK蛋白在尿液中的表達

結果顯示，膀胱尿路上皮癌患者尿液中DEK相對表達量（0.834±0.496）明顯高于對照組（0.242± 0.091），差異具有統計學意義（F=8.318，P=0.007），以對照組DEK平均值±1.96SD（0.415）作為診斷膀胱癌的臨界值，陽性率可達82.1%（23/28）。

表淺性膀胱癌（0.946±0.499）與浸潤性膀胱癌（0.790±0.370）患者尿中DEK蛋白相對表達量存在差異，但不具有統計學意義（P＞0.05）；尿中DEK相對表達量在低度惡性（0.602±0.643）和高度惡性（0.690±0.527）2組間無統計學差異（P＞0.05），見表2。

3　　討論

人類DEK基因定位于染色體6p22.3，DEK蛋白由375個氨基酸組成，分子量為42×103。最早DEK在急性髓細胞性白血病的患者中發現，之后不斷發現其與多種腫瘤的發展關系密切，如急性髓系白血病、非小細胞肺癌、視網膜母細胞瘤、肝細胞癌、胃癌、膠質母細胞瘤、黑色素瘤等［5?6］，DEK蛋白的過表達也被認為與患者的術后生存時間密切相關［7?8］。DEK作為原癌基因具有抑制細胞衰老、凋亡和分化的功能，進而抑制細胞的分化和成熟，促進細胞的惡性轉化［9］。有研究［10］表明，DEK與多種腫瘤相關信號通路（p53基因通路、p16?pRB?E2F通路、NF?κB通路等）關系密切，DEK是一種可磷酸化核蛋白，其磷酸化水平與細胞凋亡密切相關，是凋亡通路中一個關鍵的功能分子［11］。

2004年EVANS等［12］采用多重PCR的方法精確定位染色體6p22位點存在基因擴增的區域，8個膀胱癌細胞系中有6種存在6p22擴增現象，DEK正位于這個狹窄區域，DNA拷貝數量增加，提示DEK在膀胱癌的癌變過程中出現增殖。在6p22.3這個區域里，DEK附近的其他基因（E2F3、ID4等）也在膀胱癌細胞系和組織中出現過表達［13］。SHEN等［14］的研究認為該區域的E2F3基因與浸潤性膀胱癌密切相關。另外一項研究［15］表明，DEK在低度惡性膀胱癌組織中有100%陽性表達，周圍正常的膀胱組織卻無表達。本研究結果顯示，癌組織中DEK的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），表淺性癌組織中的DEK陽性表達率高于浸潤性癌組織（P＜0.05），低度惡性的腫癌組織中DEK陽性表達率高于高度惡性腫瘤組織，但差異不具有統計學意義（P＞0.05），DEK的陽性表達與患者年齡、性別無關，與文獻［13，15］報道基本一致，表明DEK的高表達與膀胱尿路上皮癌的病理分級和臨床分期相關。

隨著各種細胞學和分子生物學檢測技術的發展，無創性的尿液檢查替代膀胱鏡診斷膀胱癌、監測復發及判斷預后。近年來許多尿液中特征性物質（ImmunoCyt、NMP22、透明質酸和透明質酸酶、端粒酶以及微衛星等）作為膀胱癌的腫瘤標記物被發現［16］，這些物質作為膀胱癌的早期診斷及術后隨訪的輔助診斷方法具有重要的臨床應用價值［17］。DATTA等［15］研究顯示84%的膀胱癌患者尿液中可檢測到DEK蛋白，由此推斷DEK蛋白可以作為尿液篩查的適宜分子標記物用于非侵襲性的診斷。本實驗利用半定量蛋白質印跡法檢測了28例膀胱尿路上皮癌患者和6例健康者尿液中DEK蛋白的表達，結果顯示患者尿液中DEK水平明顯高于健康人群（P＜0.05）；腫瘤早期患者尿中的DEK平均水平高于進展期（P＞0.05），表明DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌患者尿中的高表達具有提示疾病的發生和進展的意義。

表1　DEK在不同臨床因素膀胱尿路上皮癌患者癌組織的表達Tab.1　DEK expression in bladder urothelial carcinoma tissues with different clinical factors

表2　　不同病理分級及臨床分期膀胱尿路上皮癌患者尿液標本中DEK蛋白水平比較Tab.2　DEK Expression in voided urine of bladder urothelial carcinoma patients with different clinical pathological factors

綜上所述，DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌患者的組織和尿液中呈現陽性表達，與其病理分級有密切關系。組織中和尿液中的DEK高表達被認為是潛在的診斷膀胱尿路上皮癌的腫瘤標記物。由于DEK蛋白的高表達很容易被商用的抗體檢測到，因此DEK與其他腫瘤標志物聯合檢測對于膀胱尿路上皮癌的篩查和復發監測有重要意義。

［1］韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國膀胱癌發病現狀及流行趨勢分析［J］.癌癥進展，2013，11（1）：89-95.DOI：10.3969/j.issn.1672?1535.2013.01.021.

［2］JOHNSON DC，GREENE PS，NIELSEN ME.Surgical advances in bladder cancer：at what cost［J］.Urol Clin North Am，2015，42（2）：235?252.DOI：http：//dx.doi.org/10.1016/j.ucl.2015.01.005.

［3］劉彩樹，蔡森，張亞萍，等.膀胱癌尿液生物標記物的現狀與展望［J］.生理科學進展，2015（4）：255-258.

［4］PELLUCCHI F，FRESCHI M，IBRAHIM B，et al.Clinical reliability of the 2004 WHO histological classification system compared with the 1973 WHO system for Ta primary bladder tumors［J］.Urology，2011，186（6）：2194-2199.DOI：10.1016/j.juro.2011.07.070.

［5］OU Y，XIA R，LIN L，et al.Overexpression of DEK is an indicator of poor prognosis in patients with gastric adenocarcinoma［J］.Oncol Lett，2016，11（3）：1823-1828.DOI：10.3892/ol.2016.4147.

［6］YI HC，LIU YL，ZHANG ZY，et al.Overexpression of DEK gene is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Med Rep，2015，11（2）：1318-1323.DOI：10.3892/mmr.2014.2781.

［7］RIVEIRO?FALKENBACH E，SOENGAS MS.Control of tumorigne?sis and chemoresistance by the DEK oncogene［J］.Clin Cancer Res，2010，16（11）：2932-2938.DOI：10.1158/1078?0432.CCR?09?2330.

［8］LIU X，QI D，QI J，et al.Significance of DEK overexpression for the prognostic evaluation of non?small cell lung carcinoma［J］.Oncol Rep，2016，35（1）：155-162.DOI：10.3892/or.2015.4365.

［9］華穎，胡紅剛，彭向雷.DEK蛋白與細胞凋亡的研究進展［J］.中國科學C輯：生命科學，2009，39（5）：434-440.

［10］劉光明，馬洪順.DEK蛋白和腫瘤關系的研究進展［J］.中國腫瘤臨床，2015，42（9）：482-486.DOI：10.3969/j.issn.1000?8179. 20150276.

［11］KIM DW，CHAE JI，KIM JY，et al.Proteomic analysis of apoptosis related proteins regulated by proto?oncogene protein DEK［J］.J Cell Biochem，2009，106（6）：1048-1059.DOI：10.1002/jcb.22083.

［12］EVANS AJ，GALLIE BL，JEWETT MA，et al.Defining a 0.5?mb region of genomic gain on chromosome 6p22 in bladder cancer by quantitative?multiplex polymerase chain reaction［J］.Am J Pathol，2004，164（1）：285-293.DOI：10.1016/S0002?9440（10）63118?5.

［13］WU Q，HOFFMANN MJ，HARTMANN FH，et al.Amplification and overexpression of the ID4 gene at 6p22.3 in bladder cancer ［J］.Mol Cancer，2005，4（1）：16.DOI：10.1186/1476?4598?4?16.

［14］SHEN H，MORRISON CD，CANDACE JS，et al.6p22.3 amplifica?tion as a biomarker and potential therapeutic target of advanced stage bladder cancer［J］.Oncotarget，2013，4（11）：2124-2134. DOI：10.18632/oncotarget.1485.

［15］DATTA A，ADELSON ME，MOGILEVKIN Y，et al.Oncoprotein DEK as a tissue and urinary biomarker for bladder cancer［J］. BMC Cancer，2011，11：234.DOI：10.1186/1471?2407?11?234.

［16］孔垂澤.尿液中膀胱癌特征性物質的研究進展［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（6）：835-836.DOI：10.3760/cma.j.issn.1001?9030.2011.06.002.

［17］楊青，李俊.膀胱癌尿脫落細胞學檢查與尿液腫瘤標志物研究進展［J］.安徽醫藥，2012，12（4）：528-529.DOI：10.3969/j. issn.1009?6469.2012.04.051.

（編輯武玉欣）

Expression of DEK Protein in the Tissue and Voided Urine of Patients with Bladder Urothelial Carcinoma and Its Clinical Significance

WU Qiong1，WANG Yibing2，YANG Tengfei1

（1.International Medical Service Center，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Urology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo detect the presence of DEK protein in the tissue and voided urine of patients with bladder urothelial carcinoma，and an?alyze the relationship between DEK protein and clinical pathological classification of bladder cancer.MethodsThe expression of DEK protein was examined by immunohistochemistry in 48 bladder cancer tissues and 18 adjacent normal tissues（control group）.The presence of DEK protein in voided urine was analyzed by western blot in 28 bladder cancer patients and 6 healthy individuals（control group）.ResultsThe positive ex?pression of DEK protein in bladder tumor tissues（73%）is higher than in adjacent normal tissues（33%，P＜0.05）.The expression of DEK in su?perficial bladder cancer（86%）was found higher than invasive bladder cancer（55%）with significant differences（P＜0.05）.The expression of DEK in urine samples of bladder cancer patients（0.834）was found higher than control group（0.242，P＜0.05）；Compared with the DEK expres?sion of control group，the sensitivity of diagnosis of bladder cancer with voided urine could be 82.1%.ConclusionDEK protein positive ex?pressed in tissues and voided urine of patients with bladder urothelial carcinoma.The expression was correlated with pathological classification of bladder cancer.The positive rate of DEK expression in early stage of tumor tissues is higher than late stage.The presence of DEK protein in tissues and voided urine can be considered as a suitable biomarker for bladder cancer potentially.

bladder urothelial carcinoma；DEK protein；cancer tissue；voided urine

R737.14

A

0258-4646（2016）08-0711-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.010

遼寧省博士科研啟動基金（20121129）

吳瓊（1972-），女，主治醫師，博士. E-mail：wuq@sj?hospital.org

2016-03-29
網絡出版時間：