波爾定對破骨細胞分化及骨吸收功能的影響

徐慧慧 趙宏艷 王貴 黃晶 郭明慧 肖誠

1. 北京中醫藥大學，北京 100029 2. 中日友好醫院臨床醫學研究所，北京 100029 3. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700

波爾定(Boldine)是從豆豉姜中提取的一種阿樸菲類異喹啉生物堿，豆豉姜為山雞椒Litseacubeba(Lour)Pers.的根及根莖, 是治療風濕痹癥的常用藥之一，已有研究證明其對完全弗氏佐劑誘導的關節炎大鼠具有較好的抑制作用[1]。課題組前期研究顯示波爾定可以改善II型膠原誘導關節炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠骨微結構[2]，對CIA大鼠引起的骨質疏松具有較好的抑制作用，但具體作用機制尚未明確。

正常的骨代謝依賴著骨吸收與骨形成的平衡，若這一過程受到破壞，骨吸收速度大于骨形成，則會引起骨量的丟失。破骨細胞(osteoclast，OC)在骨吸收這一環節扮演著重要角色，其成熟過程與功能的正常與否將會直接影響體內的骨量，從而進一步影響骨組織的微觀結構。所以本課題通過體外培養OC的方法，觀察波爾定對OC的分化功能及骨吸收功能的影響，以期探索波爾定改善骨組織微觀結構的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

小鼠單核細胞RAW264.7細胞株購自北京協和醫學院基礎醫學細胞中心。

1.2 試劑

高糖DMEM培養基、青霉素、鏈霉素，美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)，美國BioTech公司；小鼠重組核因子κB受體活化因子配基(RANKL)，美國Peprotech公司；牛骨片，英國Immunodiagnostic Systems Limited公司；RIPA裂解液，美國Cell Signaling Technology公司；酒石酸鈉，國藥集團化學有限公司；抗酒石酸磷酸酶(Tartrate Resistant Alkaline Phosphatase，TRAP)試劑盒、甲苯胺藍及磷酸對硝基苯酯，美國sigma公司；Trizol試劑，美國life technologies公司；CCK-8試劑盒，日本DOJINDO公司；引物合成，美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，日本Takara公司。

1.3 藥物

波爾定由北京中醫藥大學柴興云博士提供，HPLC檢測后純度>98%。提取方法如下：總重50kg的干燥豆豉姜藥材，用10倍的95%乙醇提取2次，75%乙醇提取1次，每次2h。回收乙醇后得到總浸膏，氯仿萃取后，加NH3·H2O調PH10，以正丁醇萃取后經硅膠柱色譜分離氯仿-甲醇梯度洗脫，得到18個流分(LB1-18)。其中的LB10經硅膠柱色譜再次分離，乙酸乙酯-甲醇洗脫得到12個流分(LB10A-L)，最終將其中的LB10E經ODS柱分離得到波爾定[3]。

1.4 主要儀器與耗材

細胞培養皿及培養板，美國Corning公司；二氧化碳培養箱、Varioskan Flash全波長掃描熒光酶標儀及分光光度計，美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 OC的誘導與培養

將RAW264.7細胞調節成2×103個/孔接種于96孔板中，待細胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養液培養。培養于37℃、5%CO2培養箱中，每2d換液一次，保持RANKL濃度不變。

2.2 分組與處理

按上述方法將RAW264.7細胞調節成2×103個/孔接種于預置無菌蓋玻片或牛骨片的96孔板中，待細胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養液培養，同時加入不同濃度波爾定進行干預。共設六組，對照組和濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的波爾定組，每組平行做三個復孔，所有檢測指標重復三次。

2.3 破骨樣細胞計數

按上述方法培養至第4d，按TRAP染色試劑盒說明書方法進行染色，計算整張玻片破骨樣細胞(TRAP染色陽性且細胞核多于3個的為破骨樣細胞)。

2.4 TRAP活性檢測

細胞培養至4 d，棄上清，每孔加入50 μl RIPA裂解液，冰上孵育10 min，離心后收集上清，轉移至新的96孔板中，加入50 μl TRAP 活性反應液(100 mmol/L檸檬酸鈉，pH 5.0，50 mmol/L酒石酸鈉，5 mmol/L磷酸對硝基苯酯)，37℃避光孵育1 h后，加入50 μl的0.1 mol/L NaOH終止反應，于405 nm波長檢測吸光度值。

2.5 細胞毒性實驗

將RAW264.7細胞以2×103個/孔的濃度接種至96孔板，按上述方法誘導至第4d，每孔加入10 μl CCK-8反應液，37℃避光孵育3 h，于450 nm檢測吸光度值，計算細胞存活率。

2.6 骨吸收陷窩分析

細胞培養至第9天，取出骨片在 2.5%戊二醛中固定7 min。在 0.25 mol/L 氫氧化銨中以超聲清洗10 min 去除骨片上的細胞。經系列乙醇(體積比分別為40%、75%、95%和100%乙醇)脫水，每次5 min，自然晾干后經1%甲苯胺藍室溫染色5 min，用三蒸水沖洗后在100倍光學顯微鏡下觀察，采用Leica Qwin圖像分析系統計算骨陷窩面積。

2.7 Real time-PCR方法檢測RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達

圖1 不同濃度波爾定對RANKL誘導的破骨細胞分化影響 (×100)，與對照組(Boldine 0 μmol/L)比較：*P<0.05，**P<0.01Fig.1 TRAP staining shows the effect of boldine on RANKL-induced osteoclast (×100)，*P<0.05,**P<0.01 vs control group(Boldine 0 μmol/L)

細胞誘導至第4d，棄上清，加入1 ml TRIzol裂解液震蕩混勻至細胞完全裂解。提取細胞總RNA，瓊脂糖電泳法檢測RANK，NFATc1和c-fos mRNA基因濃度及完整性。所用引物為Invitrogen公司合成，引物序列為：RANK (157bp) 上游引物CCATCATCTTCGGCGTTTAC，下游引物TCTTGCTGACTGGAGGTTGC；NFATc1 (197bp)上游引物TCGGCGGGAAGAAGATGGT，下游引物GACTTGGACGGGGCTGGTTA；c-fos (129bp)上游引物CTTGAAGATGAGAAGTCTGCGTT，下游引物CTCTGGGAAGCCAAGGTCAT；內參ACTIN (189bp)上游引物AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA。其他方法均參照試劑盒說明書進行，并進行擴增曲線和溶解曲線分析。根據檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各組目的基因相對定量結果。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 波爾定對破骨細胞分化的影響

RAW264.7細胞為圓形的單核細胞，體積較小。加入RANKL后，單核細胞逐漸融合匯聚，體積逐漸增大，誘導至4d分化為多核的OC。TRAP為OC特異性標志酶，成熟的OC對TRAP染色呈陽性。TRAP染色陽性細胞且細胞核≥3為破骨樣細胞。

與對照組相比，1 μmol/L和10 μmol/L波爾定對OC分化有下降趨勢，但無統計學差異。20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組OC數量明顯少于對照組(P<0.05)。結果見圖1。

3.2 波爾定對破骨細胞TRAP活性及毒性的影響

20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組TRAP活性明顯降低，與對照組比較具有統計學差異(P<0.05)。CCK-8結果顯示各濃度波爾定對OC均未產生毒性，說明波爾定對OC分化的抑制作用不是藥物毒性所致。結果見圖2及圖3。

圖4 不同濃度波爾定對破骨細胞所致骨陷窩吸收面積的比較(×100)Fig.4 The effect of boldine on osteoclastic bone resorption area(×100)

圖2 不同濃度波爾定對RANKL誘導的破骨細胞TRAP活性的比較Fig.2 The effect of boldine on the TRAP activity of RANKL-induced osteoclast

圖3 不同濃度波爾定對RANKL誘導的破骨細胞毒性的比較Fig.3 The effect of boldine on the cell viability of RANKL-induced osteoclast

3.3 波爾定對破骨細胞骨吸收功能的影響

藥物干預9d后，骨片經甲苯胺藍染色后，對照組、1 μmol/L和10 μmol/L波爾定組可見明顯骨吸收陷窩，邊界清晰，呈大小不等的圓形或臘腸形。骨吸收陷窩面積隨著波爾定濃度的提高呈減小趨勢，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L濃度波爾定組陷窩面積明顯低于對照組(P<0.05，P<0.01)。

3.4 波爾定對破骨細胞分化相關基因表達的影響

與對照組相比，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定可明顯抑制RANK基因的表達(P<0.05，P<0.01)；而且，對NFATc1和c-fos基因表達的抑制作用隨著藥物濃度的增加而更加顯著(P<0.05，P<0.01)。結果見圖5。

圖5 不同濃度波爾定對破骨細胞分化基因RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達的比較Fig.5 The effect of Boldine on mRNA expression of RANK, NFATc1 and c-fos in osteoclasts

4 討論

波爾定是從豆豉姜中提取出的一種阿樸菲類異喹生物堿，有報道顯示，波爾定能夠作為一種有效的抗氧化劑達到抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病的效應，在高血壓和糖尿病大鼠模型中可通過干擾氧化應激介導的信號通路起到內皮保護作用[4]。另外有研究發現，波爾定可誘導癌癥細胞凋亡，降低NF-κB信號通路的激活，在腫瘤的侵潤過程中起到重要抑制作用[5]。本課題組前期通過動物實驗研究顯示波爾定可以改善CIA大鼠骨組織微觀結構，對CIA大鼠引起的骨質疏松具有較好的抑制作用。骨質疏松是由于骨代謝的失衡，破骨量大于成骨量所致。OC的分化或其功能的改變所導致的骨改建失衡是骨質疏松的重要病理基礎[6]。所以本課題以OC為切入點，以期進一步闡明波爾定改善骨組織微觀結構的作用機制。

OC是一類多核巨細胞主要來源于骨髓造血干細胞分化的單核/巨噬細胞系，在M-CSF和RANKL的存在下，可分化為破骨樣細胞[7]。目前應用較多的是采用小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7誘導OC的方法進行研究[8]，該細胞株在RANKL的刺激下可誘導為破骨樣細胞。抗酒石酸磷酸酶(TRAP)是OC的特異性標志酶，通過TRAP染色可以計數OC的數量，本實驗研究發現20μmol/L波爾定即可抑制OC分化，更高濃度波爾定的抑制作用則更加明顯；TRAP活性檢測也得到了相同的研究結果。為進一步檢測OC的功能，我們采用OC與牛骨片共培養的方法，進一步顯示波爾定可明顯抑制OC的骨吸收功能。

RANK是RANKL的受體，位于OC及其前體細胞的細胞膜表面上。在OC成熟過程中，RANK發揮重要作用。當與RANKL結合后可促進單核細胞聚集從而分化為成熟的OC[9]，本研究發現20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的波爾定可顯著抑制RANK mRNA的表達，說明波爾定可能是通過降低RANK的表達，從而阻止其與RANKL的結合，從而抑制OC前體細胞的成熟來達到抑制OC分化和功能的目的。在OC分化過程中c-fos是一種重要調控因子，通過啟動NFATc1促進OC的分化與骨吸收功能[10]。NFATc1是一種重要的轉錄因子，其與c-fos在OC融合過程發揮重要作用[11]，已有研究顯示NFATc1在無RANKL的條件下亦可刺激前體細胞分化成OC[12]。本研究顯示波爾定抑制了OC中NFATc1和c-fos的mRNA表達。

綜上，波爾定可以抑制OC分化成熟相關的特異性基因RANK、NFATc1和c-fos的表達，從而影響OC的分化成熟及骨吸收功能，這一研究為進一步闡明波爾定改善骨組織微觀結構的作用機制提供了依據。