不同雙膦酸鹽類藥物在骨代謝的實驗研究

李冬梅 高克加

1. 上海市同仁醫院藥學部，上海 200336 2. 上海市黃浦區中心醫院核醫學科，上海 200002

隨著城市人口的老齡化的增加，骨質疏松癥及相關的并發癥已成為全球關注的健康難題[1-3]。雖然目前治療骨質疏松癥的方法不少，而雙膦酸鹽類藥物是治療骨質疏松的一種主流藥物，但不同的雙膦酸鹽藥物治療結果并不一樣，并以實驗分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

制作骨質疏松動物模型的實驗兔由上海生旺實驗動物養殖有限公司提供；動物實驗場所為上海市交通大學第六人民醫院動物實驗室。

1.2 實驗藥品

放射性骨顯像劑“99mTc-MDP”(锝-99-m-亞甲基二磷酸鈉)由上海欣科藥業有限公司提供；治療藥物“99Tc-MDP”(锝-99-亞甲基二磷酸鈉)由成都云克藥業責任有限公司提供：其中A瓶為99Tc液5.5 μg/5ml/瓶，B瓶MDP為5 mg/瓶，用于治療類風濕性關節炎和骨性疾病；治療骨質疏松癥的代表藥物“氨基二膦酸鹽”(阿侖磷酸鈉)由默沙東(意大利)美國默克公司分部提供70 mg/片；治療轉移性骨腫瘤藥物“帕米磷酸二鈉”(博寧)由深圳海王藥業有限公司購置，15 mg/瓶(凍干粉劑)； “地塞米松磷酸鈉注射液”(DX)5 mg/1 ml/支，由辰欣藥業股份有限公司生產。

1.3 檢測儀器

骨密度測定儀(雙能X線骨密度儀LUNAR.DXP-L.USA)。骨生物力學測定(骨力學測試儀INSTRON-5543.USA)。CT為飛利浦CT-SECURA，X線攝片、病理、骨形態計量檢測及生化儀均為常規設備。

2 方法

2.1 動物分組

健康雌性新西蘭實驗兔56只，平均體重3.0±0.18 kg。實驗分為二個階段進行，第一階段(制作骨質疏松模型階段)，按隨機數字表排列形式將實驗兔分為正常組16只，骨質疏松模型組40只。制作骨質疏松模型第6周時，二組各處死8只，以證實骨質疏松模型成立。余下的試驗兔在第二階段(治療觀察階段)，設計為：A組(正常對照組，余下的8只正常兔)；另余下的骨質疏松模型組分為B組(骨質疏松對照組)；C組(“99Tc-MDP”治療組)；D組(“阿侖膦酸鈉”治療組)；E 組(“博寧”治療組)，每組8只，治療觀察總療程為16周。

2.2 骨質疏松動物模型制作

參照相關制作兔骨質疏松模型資料[4-5]，實驗兔購入先適應性飼養2周，對正常組采用生理鹽水2 ml肌肉注射，但不注射DX針劑；對40只骨質疏松模型組的試驗兔實行肌肉注射鹽酸地塞米松針劑：2 mg/kg/次肌肉注射，每周2次，連續6周，兩組各處死8只，并進行相關實驗室指標的檢測，用以正實骨質疏松模型成立。6周后進行第二階段試驗：A組(正常對照組，與第一階段的正常組同樣操作)，其他B、C、D、E組第7周后繼續維持DX肌肉注射，但劑量改為1次/周，直至試驗結束。

2.3 治療方法

“99Tc-MDP”治療組，參照臨床成人治療用藥方法：將A瓶中99Tc液5 ml注入B瓶內，搖勻1分鐘后，治療量用生理鹽水稀釋后以0.2 mg/5 ml/kg對C組進行耳靜脈推注治療，每周1次。“阿侖膦酸鈉”治療組，按成人常規劑量，0.2 mg/3 ml/kg用水溶解后清晨給實驗兔采用軟管喂服，1次/周。“博寧”治療組以1 mg/10 ml/kg劑量經實驗兔耳靜脈注射治療，每周1次。總療程為16周。

2.4 實驗室觀察檢測指標

病理骨組織學、骨密度、骨形態計量、生物力學試驗、放射性“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值(此顯像是一種成骨性的功能性顯像，升高是成骨需求的標志，顯像中放射性分布所感興趣的區域稱為RIO，取實驗兔股骨頭與股骨中段相比較值)、X線、CT攝片及血清骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)。

3 檢測方法

3.1 取材方法

取第三腰椎(L3)和右側股骨頭行病理細胞學、骨形態計量分析(骨小梁體積%)、第四腰椎(L4)和左側股骨行骨密度檢測(分別采用整體股骨、單個椎體進行檢測骨密度，g/cm2)、生物力學試驗(分別以股骨三點彎曲、腰椎壓縮方法、最大壓縮載荷試驗，單位為牛頓N)，處死前進行X線攝片、CT攝片、“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值、血清BALP(骨堿性磷酸酶)、BGP(骨鈣素)指標進行檢測。

3.2 相對療效評判

將治療后的各組動物試驗結果與B組相比較，根據骨細胞學、骨密度、骨生物力學、形態計量和X線攝片、CT攝片的骨小梁密度變化及“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值上升或下降、血清BALP、BGP值的增高或降低結果相對評判為為顯效、有效和無效。

顯效：病理切片見骨組織中骨小梁增多、增粗，骨密度、骨力學、骨形態計量增加≥5%，99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值降低率>5%，血清BALP、BGP在原來的基礎上降低率>15%，X線攝片和CT攝片不變或略見密度提高。

有效：病理切片見骨組織中骨小梁密度略有所增加，骨密度、骨力學、骨形態計量增加<5%，>0，99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值降低率<5%，>0，血清BALP、BGP在原來的基礎上降低率<15%>0；X線攝片和CT攝片無改變。

無效：各治療組與B組相比較，各指標改變不明顯或加重。

3.3 統計學處理

4 結果

4.1 第一階段試驗

第一階段試驗結果，正常組與骨質疏松模型組之間試驗指標存在較大的差異。骨病理學切片顯示：正常組股骨頭的骨細胞和骨小梁排列規則，骨組織和關節表面未見骨質破壞。而骨質疏松動物模型組則表現為股骨頭骨小梁稀疏明顯，有斷裂現象。X線、CT攝片示骨質疏松動物模型組的骨小梁略有所稀疏差異。骨密度、骨力學、骨形態計量、99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、BALP、BGP等試驗結果經二組間差異明顯(P<0.05)。并存在一定的規律性改變，見表1，由此證實經DX誘導的兔骨質疏松模型成立。

4.2 第二階段試驗

對C、D、E組實驗兔進行治療16周后，采用與第一階段相似的實驗室檢測，病理切片顯示：正常組與A組和骨質疏松動物模型組與B組結果基本相似； 而 C、D、E組在B組的基礎上均有所改善，骨小梁排列密度提高依次為C組、D組和E組，見圖1。X線攝片、CT攝片攝片差異仍不明顯，但99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、血清ALP、BGP檢測結果均存在不同程度的差異。以B組為基礎，各組的病理組織學、骨密度、生物力學、99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、血清ALP、BGP檢測的改善程度，C組改善最明顯(顯效)，D組和E組為有效，但E組變化較小。見表2。

表1 制模6周時實驗室檢測結果Table 1 Laboratory test results were detected at 6 weeks after successful molding

4.3 實驗兔情況

在實驗中，骨質疏松組有1只實驗兔于第5周時死亡，A組1只、B組有2只、E組1只實驗兔分別于第10、11、13、15周因腹瀉死亡，其他實驗兔的一般情況尚屬正常。

5 討論

雙膦酸鹽類藥物能夠治療骨質疏松癥的關鍵是具有穩定P-C-P結構，能抵御生物酶解作用，對破骨細胞發揮細胞毒作用，誘導成骨細胞分泌抑制因子，阻斷破骨細胞啟動的破骨過程，抑制骨吸收，強力親和磷酸鈣，吸附于骨組織中羥基磷灰石結晶表面，抑制其結晶和非結晶前體物質形成，阻止骨骼中鈣鹽“逸出”[6]，從而達到改善骨質疏松的現象。但抑制骨吸收的作用大小與各種雙膦酸鹽特點所不同。

“99Tc-MDP”治療組、“阿侖膦酸鈉”和“博寧”都屬于雙膦酸鹽類藥物，但各有其治療價值。“阿侖膦酸鈉”在骨質代謝中能夠明顯抑制破骨細胞的活性作用，被認為與抑制破骨細胞的功能和抑制骨鈣的流失有關[7-8]，是臨床上治療骨質疏松癥的主要藥物之一。“99Tc-MDP”有較好的親骨性，而且“99Tc-MDP”中的微量元素锝-99(99Tc)能夠發生化學價態的變化，通過其失去或者獲得電子的過程中而不斷消除人體內的自由基。有報道99Tc在人體內具有調節機體的免疫功能的作用，保護過氧化歧酶(SOD)的活力，防止自由基對組織的破壞，并對炎性介質和免疫調節因子白介素Ⅰ(IL-1)的產生有抑制作用，從而起到調節人體免疫功能的作用[9-11]。可見“99Tc-MDP”在治療骨質疏松中，不僅具有雙膦酸鹽抑制骨鈣的流失的作用，可能存在更有價值的調節骨代謝的功效，對存在免疫性疾病的骨質疏松療效更明顯。“博寧”主要用于治療轉移性骨腫瘤，通過抑制破骨細胞吞噬骨質、抑制骨吸收從而起到阻止骨溶解的作用，是骨磷作用的10倍[12]。

圖1 A、B、C、D、E病理圖片(HE染色10×40)Fig.1 Pathohistology structure of femoral head in different groups (HE dyeing 10×40)

表2 治療16周實驗室檢測結果Table 2 Laboratory test results were detected at 16 weeks with treatment

通過動物實驗顯示，在骨質疏松模型的基礎上經C組、D組和E 組治療，均有較明顯的改善，但療效不一樣。“博寧”雖然具有抑制破骨細胞吞噬骨質的作用，以前往往用于抑制轉移性骨腫瘤的急性擴展和止痛；而“阿侖膦酸鈉”是在藥物“博寧”的療效基礎上研制的新一代治療骨質疏松癥的雙膦酸鹽類藥物，對骨組織過快的骨吸收進行抑制而提高了治療價值，所以實驗中“阿侖膦酸鈉”治療骨質疏松的療效優于“博寧”。而“99Tc-MDP”是在雙膦酸鹽上標記一種穩定的微量元素锝-99，治療骨質疏松療效更明顯，說明锝-99在P-C-P結構上功能鍵的結構差異，療效價值也不同，在雙膦酸鹽分子上，螯合上微量元素锝-99以后，不光有抑制骨吸收外，可能對骨組織存在免疫調節價值。由此可見，對骨質疏松的治療應該了解雙膦酸鹽類藥物的療效價值，針對性地選擇雙膦酸鹽類藥物將可為臨床治療骨質疏松癥提供依據。