經典Wnt信號通路對骨代謝的調節作用

徐偉麗 牛玲玲 王文俠 崔鵬舉

1. 哈爾濱工業大學化工學院食品科學系，哈爾濱 150090 2. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，齊齊哈爾 161006

Wnt信號通路在各種生物中具有高度的保守性，對于細胞的分化、生長、凋亡及細胞功能的表達都有重要作用，為生物生長發育所必需。Wnt信號通路包含3條通路：經典Wnt/ β-catenin信號通路，非經典Wnt/鈣離子(Wnt/Ca2+)通路和Wnt/PCP(planar cell polarity，PCP)通路。與經典通路相比，非經典通路并不依賴胞內的β-catenin，而是通過調節細胞內Ca2+濃度或細胞極性來實現其功能[1,2]。目前，人類基因研究和小鼠實驗都證明Wnt信號通路在調控骨形成過程中發揮著重要作用。Wnt信號通路在骨形成中核心作用的確認，使它成為開發防治骨骼類疾病新藥的非常有吸引力的目標[1]。該信號通路已成為目前骨骼系統相關疾病發病機制和骨代謝研究的新熱點，現就相關報道綜述如下。

1 經典Wnt信號通路的調控機理

Wnt/β-catenin通路的主要作用機制(見圖1)是胞外的Wnt蛋白與膜上的受體蛋白復合物結合(由卷曲蛋白(Frizzled，Fz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL receptor related protein，LRP5/6組成)，激活胞內的散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)誘導胞內的四聚體(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)解體，從而使細胞內的β-catenin濃度升高，進入細胞核內與轉錄因子(T cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結合，最終誘導靶基因(cyclinD1、c-myc、Runx2、Osx等)的表達。在沒有Wnt蛋白存在的情況下，四聚體將β-catenin泛素化標記并最終通過泛素化途徑降解，使其濃度降低而抑制靶基因的表達[3]。

圖1 經典Wnt信號通路[4]Fig.1 Classic Wnt signaling[4]

2 與骨代謝相關的胞外成分—— Wnt

Wnt蛋白家族由19種分泌型富含半胱氨酸的蛋白質組成，在骨細胞形成和骨構建過程中起重要作用[5]。Wnt1類(Wnt1和Wnt3a)與經典Wnt通路相關，它通過和卷曲蛋白、LRP5/6形成復合蛋白來激活經典Wnt通路[6]。該復合體會引起GSK3β的磷酸化并導致其失活，這一過程能夠抑制β-catenin的降解，促進其在細胞核中積累進而發揮作用[7]。非經典的Wnt5a類和卷曲蛋白結合，激活三聯體G偶聯蛋白，并且通過C依賴蛋白激酶系統或者JNK依賴的蛋白激酶來提高胞內的鈣離子濃度，從而影響細胞骨架的形成[8]。

Wnts能夠通過經典和非經典通路抑制成熟的成骨細胞凋亡，從而延長它的壽命[9]。Wnts也能夠直接作用于破骨細胞，降低破骨細胞中的β-catenin濃度從而增加破骨細胞的數目，增加骨吸收，降低骨量[10]。最新研究發現，在早發型骨質疏松和成骨不全癥患者的常染色體中，Wnt1基因發生了錯義突變[11]。

由骨細胞分泌的硬骨素(Sclerostin)，能夠和Wnt蛋白競爭LRP5/6在胞外的結合位點。硬骨素的缺乏，會啟動Wnt信號通路，從而導致人和鼠體內的骨量急劇上升。處在失重狀況下的宇航員會快速的流失大量骨質，就是由于骨細胞響應相關的機械刺激，分泌的硬骨素升高造成的[12,13,14]。甲旁腺素(parathyroid hormone，PTH)能夠抑制骨細胞產生硬骨素，從而通過Wnt通路增加骨量來治療骨質疏松，這也是目前唯一被廣泛認可的治療方案[15]。硬骨素的人源單克隆抗體—Romosozumab，能夠升高骨密度(bone mineral density，BMD)并促進骨形成，減少骨重吸收。在一項針對低BMD的絕經后婦女實驗中(為期1年)，Romosozumab作用組BMD的增長幅度(11.3%)比bisphosphonate alendronate(4.1%)和PTH(7.1%)都要大[16]。目前這個藥物已進入三期臨床試驗階段，進一步驗證它對BMD的確切療效及長期服用的副作用[17]。

3 與骨代謝相關的胞內成分

3.1 Axin

脊椎動物的兩種Axin基因分別表達Axin和Axin2蛋白。兩者的功能相似，但是Axin持續表達，而Axin2只有在Wnt通路激活時才表達，并且起到負反饋調節的作用；另外，Axin廣泛表達，而Axin2只在特定的組織表達[18]。人類Axin2的基因突變有可能導致遺傳性牙齒發育不全、直腸癌等[19]。在人胚胎早期，母體缺乏Axin會導致最初的糖原降解滯后。對S2細胞進行Axin-RNAi實驗，結果表明內源性糖原水平以及GSK3β都有所升高[20]。

Axin是四合體的骨架蛋白，N末端的RSG區域和APC(adenomatous polyposis coli)結合。C末端的DIX區域和散亂蛋白的相關區域功能類似，主要促進兩者間的相互作用。另外還有單獨作用于β-catenin、GSK-3β和CKIa的區域以及與磷酸酶PP2A作用的區域。當Wnt蛋白與LRP5結合后，Axin就被征募到細胞膜，與LRP5的胞內區域相互作用，進而阻止Axin參與β-catenin的降解過程[21]。Wynne Peterson-Nedry等發現完全敲除果蠅Axin上APC、GSK3或β-catenin結合位點，也只是導致中度的發育遲緩，因此他們認為Axin和另外的三聚體結合，主要作用是大大提高復合體的穩定性[22]。

3.2 GSK-3β

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一種絲氨酸(S)/蘇氨酸(T)激酶，在哺乳動物中有α(51ku)和β(47ku)兩種類型。GSK的酶活性受磷酸化位點的影響：GSK3β的9位和GSK3α的21位絲氨酸磷酸化是非活性形式，GSK3β的216位和GSK3α的279位酪氨酸磷酸化是活性形式[23]。GSK-3β在Wnt信號途徑中通過與Axin結合磷酸化β-catenin末端的3個絲氨酸/蘇氨酸(S33，S37，T41)，促進β-catenin被特定的泛素酶系統識別。Axin上也有CKIα的結合位點，其主要是通過磷酸化β-catenin的45位絲氨酸，來促進GSK-3β的磷酸化過程。在細胞內GSK3β還可以磷酸化Wnt通路的其他成分如Axin，APC等，這一作用能夠增強它們與β-catenin結合的能力，并提高Axin的穩定性[24]。Dvl與Fz/LRP復合體結合后被激活，然后將GBP帶入四聚體復合物，可使GSK-3β從Axin上解離，抑制β-catenin的降解[25]。

GSK3β對成骨細胞的形成和分化有重要的影響。實驗表明GSK-3β的抑制劑如LiCl能夠使骨質疏松的小鼠骨量增加，骨礦物質密度顯著提高[26]。鋰雖然被用來治療極性功能紊亂病，但是卻會造成病人骨礦化密度降低[27]，對其進一步跟蹤研究表明，停止服用后有增加骨折的風險，[28]。Gregory等用GSK3β抑制劑(2’Z, 3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime(BIO)作用于斑馬魚(zebrafish)，發現使用GSK3β的抑制劑能夠促進魚鰭再生[29]。Sisask等將GSK3β的抑制劑AZD2858作用于股骨骨折的小鼠，作用一周后能明顯增加骨痂中骨礦化密度和升高骨礦物質含量，在沒有先形成軟骨組織的情況下快速治愈骨折[30]。這些研究結果表明GSK3β是骨質疏松預防治療的靶點。但是，由于GSK-3β分布廣泛，而且它在多種信號通路中同時存在，與人的多種疾病如神經系統錯亂、糖尿病、炎癥、癌癥、心力衰竭等密切相關，所以限制了它在治療骨質疏松癥中的應用[31]。

GSK-3β對破骨細胞的形成也有重要的影響，GSK3β的非活性狀態對于單核巨噬細胞分化為破骨細胞尤為重要。有報道指出GSK3β的非活性形式促進了破骨細胞的形成[32]；而采用抑制上游調控因子RANKL的方式抑制GSK3β的表達，會抑制破骨細胞的形成。因此，關于GSK對于破骨細胞形成的確切作用機制還不清楚，仍需進一步研究[33]。

3.3 β-catenin

β-catenin由染色體3p21-22的CTNNbl基因編碼，其N端由130個氨基酸組成，是GSK-3β的作用位點。C末端的100個氨基酸主要通過與LEF/TCF結合發揮作用。中間連接臂還有550個氨基酸[34]。β-catenin主要通過胞質中的濃度起作用。在沒有Wnt存在的情況下，其一端被固定在細胞膜上，另一端與GSK-3β、APC、Axin結合，被GSK-3β磷酸化標記后，通過泛素化酶水解系統降解，保持低濃度。在Wnt存在的情況下，通路被激活，四聚體復合物解體，β-catenin降解不發生，高濃度的β-catenin進入細胞核中發揮作用[6]。

體內和體外實驗均證明β-catenin是影響Runx2基因表達的重要因素，可以通過抑制間質細胞Runx2基因的表達，從而抑制間質細胞向成骨細胞的轉化，促進其轉化為軟骨細胞[35]。Holmen等在體外實驗中發現成骨細胞中β-catenin基因的缺失會導致幾種骨質疏松癥，并且影響成骨細胞的分化。在體內試驗中，成骨細胞中該基因的缺失會導致體內由核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)激活的骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)和相關受體的改變，影響破骨細胞的生成。從而在基因層面證明了破骨細胞中β-catenin的異常調節會導致骨發育不良，并證明了成骨細胞中的Wnt/β-catenin通路和破骨細胞的功能轉變相關[36]。

Xu等對480位絕經后骨質疏松患者和170位正常絕經后婦女調查后發現，前者比后者血清中的β-catenin水平要低。在絕經后骨質疏松患者血清中，β-catenin與OPG正相關，跟RANKL/OPG、體重指數、硬骨素負相關。這說明絕經后骨質疏松的發病可能和血清中β-catenin濃度的降低和RANKL/OPG比率的升高有關[37]。

4 與骨代謝相關的核內因子——Runx2/Cbfa1

Runx/Cbfa/Aml/Pebp轉錄因子家族包含3個單獨的基因。Cbfa1(Core binding factor a1)/Runx2(tunt related transcriptional factor a1) 能夠決定多功能間質干細胞向成骨細胞的分化，其作用機理包括早期誘導成骨細胞的分化和后期抑制它的凋亡[38]，在成骨細胞中的分布最多(在成骨細胞中，Cbfa1和骨鈣素基因、膠原蛋白Ia、骨唾液蛋白和骨橋蛋白的啟動子區相結合)，在胸腺細胞和T細胞中也有表達。Cbfa1的遺傳突變會嚴重損害人的骨形成過程，這種疾病稱為顱骨鎖骨發育不良綜合癥。小鼠體內缺乏Cbfa1基因會導致間質細胞的分化受到抑制，造成骨形成不足[39]。小鼠細胞膜和軟骨細胞中如果完全缺少Cbfa1/Runx2或者不足單倍劑量的基因表達，都會導致中央軸空病(central core disease，CCD)的發生。已有證據表明，Runx2能夠同Lef1或TCF構成復合體，結合在FGF18(成纖維細胞生長因子)啟動子上，誘導骨發育調控因子FGF18的表達[40]。體外實驗表明Runx2有多種調控作用，它能夠影響堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性、誘導不成熟間質干細胞中骨基質蛋白基因的表達、成骨細胞的礦化等[41]。

5 與骨代謝相關的下游調控因子

經典Wnt通路的下游調控基因有cyclinD1、c-myc、Runx2等。cyclinD1是細胞周期增殖信號的關鍵蛋白，主要調控細胞從G1期到S期，由β-catenin和LEF/TCF的復合體所激活[42]。c-myc基因同cyclinD1的作用類似，它能夠加速細胞的周期過程，促進成骨細胞的分化增殖[43]。核內的Runx2基因是眾多信號通路調整的共同靶基因，它的表達能夠明顯刺激成骨細胞的增殖分化[1]。

6 展望

隨著人口數量的增加、社會人口老齡化的出現，骨骼類疾病，特別是原發性骨質疏松(osteoporosis，OP)已經成為老年人、尤其是老年婦女最為常見的疾病之一。由于其患病率和死亡率高，骨骼類疾病現已成為公眾關注的健康問題。經典 Wnt/β-catenin通路對骨細胞的調控作用已經得到廣泛的證實。該信號通路涉及骨骼類疾病、癌癥等多種疾病的發生，特別是在骨骼類疾病的發病和治療過程中扮演著重要角色，所以研究更加深入。近年來對Wnt/β-catenin通路的研究主要集中于兩個方向：一是細胞核內下游靶基因的調控因子及調控路徑；二是影響通路的限制因子。Wnt通路的眾多組分為治療骨質疏松提供了大量的潛在作用靶點如Dkk1，硬骨素，各調控因子的單克隆抗體等。但是整個 Wnt/β-catenin信號轉導通路中細胞因子如何調節成骨細胞的具體機制并不完全明確。另外，骨骼在形成過程中除了受到經典和非經典的Wnt通路的調控作用外，還涉及ER通路、osteoprotegerin receptor activator for nuclear factor κ B ligand(OPG/RANKL)通路、BMP-2/Smads通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路等的調節，它們的許多成分對細胞的作用相互重疊。這些通路之間如何聯系，仍未闡明。所以，除了各個通路成分單獨作用的效果外，該成分對其他通路的作用將成為另一個研究的熱點。