苯甲酸雌二醇對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠子宮內(nèi)膜及子宮肥大細(xì)胞數(shù)量的影響

祁珊珊 王永吉

陜西理工學(xué)院維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000

婦女絕經(jīng)后因卵巢功能下降、雌激素水平驟降，體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換率顯著加快，骨吸收的速度超過骨形成的速度，導(dǎo)致骨量丟失、骨密度下降、骨骼脆性增加引起的骨質(zhì)疏松癥稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。去卵巢大鼠構(gòu)建的骨質(zhì)疏松模型是研究雌激素缺失引起的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的最適模型，該模型已廣泛應(yīng)用于雌激素缺失誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的研究中[2]。我們前期在對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢去除后不僅會(huì)引起骨質(zhì)丟失，還會(huì)引起子宮萎縮及子宮組織結(jié)構(gòu)的改變[3]，我們推測(cè)子宮形態(tài)的改變可能是由于雌激素缺失所致，給藥補(bǔ)充外源雌激素是否會(huì)使子宮復(fù)原？本研究將用組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法對(duì)這一問題進(jìn)行回答。

此外，肥大細(xì)胞是天然免疫的效應(yīng)細(xì)胞之一，在天然免疫中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體抗感染免疫的一線細(xì)胞，它能分泌40 余種生物活性物質(zhì)或細(xì)胞因子(如組胺、蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等)[4]。研究表明子宮肥大細(xì)胞數(shù)量在發(fā)情周期中發(fā)生波動(dòng)，這種波動(dòng)可能與雌激素的分泌活動(dòng)有關(guān)。現(xiàn)已證實(shí)人、倉(cāng)鼠、小鼠、山羊子宮MC的數(shù)量分布隨動(dòng)情周期的改變而呈周期性變化[5,6]，而雌激素也隨生殖周期的改變而改變。這提示了雌激素水平的改變可能是導(dǎo)致子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量改變的直接原因。然而這些研究?jī)H集中于動(dòng)情周期，卵巢是機(jī)體產(chǎn)生雌激素的重要器官，卵巢切除后大鼠子宮肥大細(xì)胞是否會(huì)受影響，補(bǔ)充外源雌激素是否會(huì)對(duì)子宮肥大細(xì)胞產(chǎn)生影響？這方面的研究目前還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究將利用組織學(xué)和組織化學(xué)的方法對(duì)上述問題進(jìn)行回答。肥大細(xì)胞在數(shù)量與分布上的變化可能與子宮局部的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只3月齡健康雌性SD大鼠(由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，為國(guó)家A級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，許可證號(hào)：SCXK2012-003)，體質(zhì)量194～230 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為手術(shù)組(OVX組)和假手術(shù)組(Sham組)，每組各半。

1.2 卵巢去除手術(shù)

手術(shù)方法見參考文獻(xiàn)[7]。

1.3 給藥及分組

大鼠卵巢去除手術(shù)后3個(gè)月，將卵巢摘除組(OVX)和假手術(shù)組(Sham)大鼠重新分組，分別是OVX組、OVX+苯甲酸雌二醇組、Sham組，每組6只，OVX+苯甲酸雌二醇組腹腔注射苯甲酸雌二醇20 μg/(kg·d)，每隔1天給藥1次，連續(xù)給藥28 d，Sham組和OVX組腹腔注射花生油作對(duì)照。具體分組及給藥方法見表1。

1.4 組織樣品采集

給藥28 d后，稱取大鼠體重，CO2麻醉后進(jìn)行眼眶靜脈采血，采血結(jié)束頸椎脫臼處死大鼠。打開腹腔，取出子宮固定于3.7%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h。

1.5 子宮組織學(xué)及肥大細(xì)胞形態(tài)觀察

子宮組織樣品進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)，分別進(jìn)行HE染色和改良甲苯胺藍(lán)染色，95%酒精分化，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察子宮組織形態(tài)和子宮肥大細(xì)胞的分布。

1.6 肥大細(xì)胞的計(jì)數(shù)

每個(gè)子宮樣本每隔 5張連續(xù)切片計(jì)數(shù)一張，共查 5張， 每張切片為一完整的子宮橫斷面，低倍鏡下(10×10)計(jì)數(shù)子宮橫斷面所有肥大細(xì)胞，并求 5張切片肥大細(xì)胞的均數(shù)，據(jù)此求得各組肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素組間方差分析和比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組動(dòng)物的處理Table 1 Treatment of animals in each group

2 結(jié)果

2.1 苯甲酸雌二醇對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)的影響

組織學(xué)觀察顯示假手術(shù)組(Sham組)大鼠子宮壁結(jié)構(gòu)正常，上皮為單層柱狀上皮，固有層分布有子宮腺，肌層為多層平滑肌，肌纖維排列緊密。去卵巢模型組(OVX組)大鼠子宮腔徑顯著變小，子宮黏膜上皮厚度較假手術(shù)組明顯減小，子宮內(nèi)膜和肌層明顯變薄，固有層子宮腺減少，腺腔狹窄，肌纖維細(xì)小。OVX大鼠給藥苯甲酸雌二醇28d后，子宮腔徑增大，黏膜上皮的厚度也明顯增大，組織形態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)見表2。

表2 大鼠子宮腔徑、肌層厚度、子宮黏膜上皮厚度的形態(tài)計(jì)量結(jié)果Table 2 The histomorphometry results of uterine cavity diameter, uterine muscle thickness, and uterine epithelium thickness in rats

2.2 子宮肥大細(xì)胞的分布及形態(tài)

圖1 肥大細(xì)胞在大鼠子宮中的分布及形態(tài)A. 子宮黏膜下層的肥大細(xì)胞 甲苯胺藍(lán) 200×；B.子宮黏膜下層血管旁的肥大細(xì)胞 甲苯胺藍(lán) 200×； C. 子宮腺體旁的肥大細(xì)胞 甲苯胺藍(lán) 400×； D. 子宮黏膜肌層的肥大細(xì)胞 甲苯胺藍(lán)400×；V. 血管；G. 腺體；箭頭所示為肥大細(xì)胞Fig.1 Distribution and morphology of mast cells in the rat uterusA. Mast cell in the submucosal of uterus, Toluidine blue staining, 200×; B. Mast cell around the lower blood vessels in the submucosal layer of uterus, Toluidine blue staining, 200×; C. Mast cells next to the gland of uterus, Toluidine blue staining, 400×; D. Mast cell in the mucous membrane of uterus, Toluidine blue staining, 400×; V. Blood vessel; G. Gland; The arrow points to the mast cells

大鼠子宮肥大細(xì)胞的分布基本一致，肥大細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿內(nèi)充滿紫紅色的異染性顆粒，并存在脫顆粒現(xiàn)象，單個(gè)散在分布于子宮中，主要分布在子宮肌層，子宮黏膜肌層平滑肌束間結(jié)締組織近小血管壁以及微血管附近居多，子宮腺周圍也有分布，子宮內(nèi)膜上皮中未發(fā)現(xiàn)(圖2)。

2.3 苯甲酸雌二醇對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量的影響

苯甲酸雌二醇對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量的影響(表3)。

表3 各組大鼠子宮橫斷面全層肥大細(xì)胞數(shù)量比較Table 3 The number of mast cells in the rat uterus

如表3所示，大鼠卵巢摘除后，子宮肥大細(xì)胞的數(shù)量較Sham組明顯增多，且差異極顯著(P<0.01)；給藥苯甲酸雌二醇后，子宮肥大細(xì)胞的數(shù)量與Sham組相比差異不顯著(P>0.05)，與OVX組相比，雌二醇給藥后肥大細(xì)胞數(shù)量較OVX組顯著減少。上述變化表明，隨著大鼠體內(nèi)雌激素水平的降低，子宮肥大細(xì)胞數(shù)量呈遞增趨勢(shì)。

3 討論

3.1 苯甲酸雌二醇對(duì)卵巢摘除大鼠子宮形態(tài)的影響

哺乳動(dòng)物的子宮是卵巢雌激素的靶器官，卵巢雌激素對(duì)于維持子宮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的意義。我們前期的的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，卵巢去除手術(shù)后3個(gè)月，與Sham組相比，OVX組大鼠子宮腔徑顯著變小，子宮肌層和黏膜上皮均明顯變薄，固有層子宮腺減少[3]。子宮的上述組織形態(tài)學(xué)變化證實(shí)雌性動(dòng)物子宮黏膜的形態(tài)受卵巢雌激素的直接調(diào)節(jié)。這與人類的研究結(jié)果一致[8]。本研究結(jié)果顯示給藥苯甲酸雌二醇28 d后大鼠子宮形態(tài)恢復(fù)正常，子宮黏膜厚度、子宮腔徑、子宮黏膜上皮厚度等均較OVX組顯著增加，證實(shí)雌激素是子宮生理的主要調(diào)節(jié)劑。

3.2 苯甲酸雌二醇對(duì)卵巢摘除大鼠子宮內(nèi)MC數(shù)量的影響

Paul Ehrlich在1878年首次發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞(mast cells，MC)，認(rèn)為其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用。肥大細(xì)胞在非特異性免疫中是重要的黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞，其能夠分泌細(xì)胞因子從而參與獲得性免疫[9]。正常情況下，肥大細(xì)胞分布于機(jī)體結(jié)締組織、消化道和呼吸道黏膜、子宮內(nèi)膜、以及血管、淋巴管周圍，肥大細(xì)胞的這種分布可使其分泌的細(xì)胞因子能被血管內(nèi)皮細(xì)胞、呼吸道、胃腸道、子宮平滑肌細(xì)胞所利用[10]。研究表明哺乳動(dòng)物(包括嚙齒類動(dòng)物)子宮肥大細(xì)胞數(shù)量在發(fā)情周期中會(huì)發(fā)生波動(dòng)，推測(cè)可能與雌激素以及孕酮的分泌活動(dòng)有關(guān)，許多研究證實(shí)倉(cāng)鼠、小鼠子宮內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量在發(fā)情周期中發(fā)生波動(dòng)[5,6]，但是這些研究?jī)H集中于發(fā)情周期，沒有涉及去卵巢。本研究運(yùn)用去除大鼠雙側(cè)卵巢阻斷雌激素的主要來源，發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠由于體內(nèi)雌激素水平的驟降導(dǎo)致子宮肥大細(xì)胞數(shù)量較Sham組大鼠急劇增加，給予去卵巢大鼠苯甲酸雌二醇28 d后，其子宮肥大細(xì)胞的數(shù)量又趨于正常，研究數(shù)據(jù)顯示雌激素水平的變化是導(dǎo)致子宮肥大細(xì)胞數(shù)量發(fā)生波動(dòng)的重要原因。

近年來，有關(guān)激素和肥大細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)之間的相互作用、相互調(diào)節(jié)機(jī)制的研究很多[11-13]。研究顯示子宮中肥大細(xì)胞的數(shù)量是衡量子宮局部細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)，較外周血T細(xì)胞數(shù)量指標(biāo)更精確，可直接反映子宮局部細(xì)胞免疫水平的變化[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢去除后，大鼠子宮內(nèi)MC的數(shù)量增多，注射外源苯甲酸雌二醇后子宮肥大細(xì)胞數(shù)量減少，提示雌二醇對(duì)子宮MC數(shù)量有直接的影響，子宮可能通過改變MC的數(shù)量調(diào)節(jié)子宮局部免疫狀態(tài)。卵巢摘除后雌激素水平顯著降低，子宮可能通過增加肥大細(xì)胞的數(shù)量調(diào)節(jié)局部免疫功能，使機(jī)體處于恒定的狀態(tài)。Narita等[14]的研究認(rèn)為，雌激素可使肥大脫顆粒，甚至細(xì)胞崩解，高濃度雌激素使肥大脫顆粒， 導(dǎo)致其數(shù)量減少， 這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。子宮內(nèi)MC數(shù)量呈動(dòng)態(tài)變化的特性，原因在于其所處器官局部微環(huán)境的不恒定性，即激素水平的不斷變化，這可能是子宮為適應(yīng)生理功能的變化而通過肥大細(xì)胞對(duì)局部免疫的一種調(diào)節(jié)方式。本研究還表明，肥大細(xì)胞在正常子宮肌層中的數(shù)量明顯多于子宮內(nèi)膜，證實(shí)子宮肌層中肥大細(xì)胞參與正常子宮平滑肌的收縮。