‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨HHT基因克隆與表達分析

呂照清,任丹丹,周　賀,喬玉山

(南京農業大學 園藝學院,南京 210095)

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‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨HHT基因克隆與表達分析

呂照清,任丹丹,周賀,喬玉山*

(南京農業大學 園藝學院,南京 210095)

摘要:該試驗以砂梨品種‘黃花’梨(果皮褐色)及其芽變‘綠黃花’梨(果皮綠色)盛花后第8周的果皮為試材，利用常規PCR和巢式PCR技術克隆了ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉移酶(ω-hydroxypalmitate O-feruloyl transferase, HHT)基因cDNA的全長，命名為 PpyHHT(登錄號為KX131155)。序列分析結果表明，該基因開放閱讀框(ORF)為1 335 bp，編碼444個氨基酸。生物信息學分析顯示，推定的PpyHHT蛋白質相對分子質量為49.91 kD，等電點是4.75，與白梨相似性高達98%，親緣關系最近。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)表達分析顯示，2種梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6～9周的4個轉色關鍵期表達量不斷變化，在‘黃花’梨果皮中的表達量明顯高于‘綠黃花’梨。推測 PpyHHT基因可能參與砂梨果實褐色/綠色性狀的形成。

關鍵詞:砂梨； HHT基因；克隆；生物信息學；基因表達

砂梨(PyruspyrifoliaNakai)原產中國，其果皮呈褐色、綠色和紅色等類型，且以褐色和綠色為主。紅皮梨果實的色澤受花青素控制，而砂梨果實褐色/綠色的形成機理與紅皮梨不同[1-2]。研究發現，砂梨果實的褐色是由于角質層和表皮細胞破損后木栓層的積累形成的[3-4]。

木栓層由木栓質片層結構組成，木栓質是由木栓聚酚結構域[suberin poly(phenolic) domain，SPPD]和木栓聚酯結構域[suberin poly(aliphatic) domain，SPAD]組成的大分子結構。SPPD主要是羥基阿魏酸及其衍生物共價連接而成，調控苯丙烷-阿魏酸途徑的酶主要有：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉移酶(HHT)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和肉桂酰CoA氧化還原酶(CCR)等[5-6]；SPAD主要由甘油、α,ω二羥基羧酸和長鏈脂肪酸等以酯鍵或醚鍵交聯而成[6-8]，參與長鏈脂肪酸代謝的酶主要有：長鏈脂肪酸酰基CoA合成酶(LACS)、β-酮酰CoA合酶(KCS)、脂肪酸ω-羥化酶(FAωH)和CYP86A脂肪酸ω-羥基化酶等[9-12]。目前已克隆的梨木栓質合成相關基因有PAL、C4H和CCR等[13-15]。

ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉移酶(ω-hydroxypalmitiate O-feruloyl transferase, HHT)是苯丙烷生物合成途徑中的關鍵酶，催化阿魏酰輔酶A生成ω-羥基棕櫚酸和1-伯醇[16]，擬南芥HHT體外試驗證實也會促進阿魏酰棕櫚酸和烷基阿魏酸酯的形成[17]。HHT直接或間接影響阿魏酸及其衍生物的表達，從而影響SPAD和SPPD大分子的結構組成。本試驗通過對‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨轉錄組數據的分析，發現HHT基因在‘黃花’及‘綠黃花’梨果實色澤形成關鍵期的表達量存在顯著差異，因此本試驗克隆了‘黃花’及‘綠黃花’梨果皮HHT基因，分析其在果實色澤形成關鍵期的表達情況，以期為探討砂梨果皮褐色形成機理提供依據。

1材料和方法

1.1材料

以江蘇省南京市溧水果園‘黃花’及其芽變‘綠黃花’梨盛花后第6、7、8、9周果實為試材，削取果皮，液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及HHT基因克隆采用改良CTAB法提取果皮總RNA[18]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取1 μg總RNA，利用PrimescriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(中國TaKaRa公司生產)反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。根據NCBI上已登錄的白梨(PyrusbretschneideriRehd.)HHT基因序列(XM_009379727)，利用Primer Premier 5設計1對特異引物，對‘黃花’梨及‘綠黃花’梨HHT基因片段進行PCR擴增，引物為HHT-F(5’-TCTCCTTTCCATTCGTCA-3’)和HHT-R(5’-AGCATCAGCAATCTCAGTG-3’)。PCR反應體系總體積為25 μL，包含模板1 μL，引物各0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O補足。PCR擴增條件為94 ℃預變性5 min；94℃ 變性20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖膠電泳檢測。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(中國Axygen公司所生產)膠回收試劑盒對目的片段回收。與載體pMD19-T連接后轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞進行藍白斑篩選。選取白色單菌落進行PCR檢測，陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.2目的基因3’端序列克隆根據擴增產物的測序結果設計2條正向巢式特異引物3W(5’-ACTTGGTCTAAGCTGTCGTT-3’)和3N(5’-ACTGAGATTGCTGATGCTTT-3’)，反向引物為R16326(5’-GGTGGTAGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTG-3’)和R16324(5’-AGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC-3’)，利用接頭引物R11466(5’-GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN-3’)以3 μg總RNA為模板合成第一鏈cDNA。PCR擴增采用巢式PCR策略，進行兩輪PCR擴增。第一輪以cDNA為模板，以3W和R16326為上下游引物，第一輪PCR產物稀釋10倍后作為第二輪PCR模板，以3N和R16324為上下游引物。第一輪/第二輪PCR程序：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 20 s，60/56 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 60 s，共35個循環；72 ℃延伸 10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，經克隆后送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.3生物信息學分析借助Clustal X和Mega 5軟件，對所得序列與GenBank中其他物種的HHT基因序列進行同源性分析，挑選典型物種進行多序列比對，Clustal X生成比對結果，利用Mega 5對比對結果構建系統發育樹，進行系統發育分析。采用DNAMAN對PpyHHT基因翻譯和氨基酸序列分析，在NCBI網站上進行Blast和保守結構域分析，Mega 5軟件進行進化樹的構建。

1.2.4PpyHHT基因定量PCR分析分別以盛花期后第6至第9周的梨果實總RNA，反轉錄得到的cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。根據已克隆的PpyHHT基因序列設計1對特異引物CO-F(5’-TCTTGTTCCTTTCTAATGGG-3’)和CO-R(5’-GGGCTCTTTCACCCACTT-3’)。以砂梨Ubiqutin基因為內參基因，引物為CO138(5’-GCTCGCAGTGCTCCAGTTCTAC-3’)和CO139(5’-AACATAGGTCAACCCGCACTT-3’)。參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒(中國TaKaRa公司所生產)說明進行qRT-PCR反應。反應體系為10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，0.3 μL上、下游引物，1 μL cDNA，ddH2O補足至20 μL。反應程序為95 ℃預變性4 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環。實時熒光定量PCR試驗使用ABI7300 cycler(美國)儀器完成，試驗數據由2-ΔΔT公式計算處理，測定樣本均設3個重復。

ATG. 起始密碼子；TAG. 終止密碼子；陰影. 保守結構序列圖1　PpyHHT基因的核苷酸序列及氨基酸序列ATG. Start codon; TAG. Stop codon; Shadow. Conserved domain sequenceFig. 1　The nucleotide acid sequence and amino sequence of PpyHHT gene

2結果與分析

2.1PpyHHT基因克隆與序列分析

用常規PCR技術從‘黃花’和‘綠黃花’梨第8周果實果皮中擴增得到部分基因片段，測序并在NCBI上進行比對分析表明，該片段為PpyHHT基因的部分片段。根據所得序列設計3’端特異引物，進行巢式PCR擴增(第一輪引物為3W和R16326，第二輪引物為3N和R16324)，獲得了3’端目的片段。利用DNAMAN6.0軟件進行拼接，獲得了包含完整開放閱讀框的核苷酸序列1 599 bp(圖1)，而且‘黃花’和‘綠黃花’cDNA序列完全一致；包括編碼444個氨基酸的編碼區，264 bp的3’非翻譯區(圖1)，命名為PpyHHT，提交GenBank，登錄號為KX131155。根據DNAMAN6.0軟件推測該蛋白分子量是49.91 kD，等電點是4.75。

2.2PpyHHT基因生物信息學分析

圖2　PpyHHT基因預測蛋白的結構域分析Fig. 2　Conserved domain analysis of prodicted protein of PpyHHT gene

圖3　‘黃花’梨與其他物種 HHT基因氨基酸序列的系統進化樹Fig. 3　Phylogenetic tree of the amino acid residues encoded by HHT gene in ‘Huanghua’ pear and other species

利用NCBI蛋白保守結構域數據庫(conserved domain database，CDD)對PpyHHT基因編碼蛋白的保守區進行預測，結果表明，該蛋白在11～443氨基酸殘基之間有一個HHT家族結構域(PLN02481，E值0e+00)(圖2)。將PpyHHT基因編碼的氨基酸序列進行比對分析，發現PpyHHT與多種植物HHT的相似性在76.6%和98%之間，其中相似性在92%以上的有白梨(Pyrusbretschneideri)、蘋果(Malusdomestica)、梅(Prunusmume)、森林草莓(Fragariavesca)等，且白梨最高達98%。分析結果還發現，PpyHHT基因編碼的氨基酸序列具有HHT的2個保守結構區域，即HXXXD(第175～179位氨基酸殘基)活性位點和D(N)F(V)GWG(第392～396位氨基酸殘基)活性位點(圖1)，這2個保守區域為酰基轉移酶所特有，在植物中高度保守[19-21]。

利用Mega 5軟件將這些基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析，構建系統進化樹。從圖3可以看出PpyHHT基因編碼的氨基酸與其他近源物種在氨基酸水平上高度同源，與白梨親緣關系最近，這與氨基酸序列比對結果一致，表明PpyHHT基因為HHT的同源基因。

2.3在不同發育時期梨果皮中PpyHHT的表達

圖4　不同時期‘黃花’梨和‘綠黃花’梨果皮PpyHHT基因表達量Fig. 4　The relative expression of PpyHHT in the peel of ‘Huanghua’ and‘Lü huanghua’pear at different stages

在所取樣的4個時期，‘黃花’梨PpyHHT基因的表達量均高于‘綠黃花’梨，在第7周表達量差異達到最大，非常有趣的是，此時‘黃花’梨果實褐色開始呈現出來，提示該基因的高表達可能與果皮褐色形成有關。在不同時期‘黃花’梨果皮中，第6周和第7周表達量較高，而第8周和第9周表達量較低，其中第7周的表達量約為第8周的4倍，褐色呈現后的第8周和第9周間表達量相差無幾，究其原因可能是PpyHHT需要與相關因子協同作用才能促成褐色前體物質的形成，隨著果實色澤的逐漸形成，協同作用減弱，其含量也逐步減少并趨于穩定。PpyHHT基因在‘綠黃花’梨果皮中表達量在第8周最低，為最高表達量的0.25倍，表達量隨果實發育呈“先減后增”趨勢，這可能是由于在色澤形成關鍵期相關物質抑制了PpyHHT基因的表達，至第9周‘黃花’梨果實表皮褐色比較明顯時，‘綠黃花’梨PpyHHT基因的表達量又增高，這個并沒有促進果實形成褐色，最合理的解釋可能是除該酶(基因)外，褐色的形成還需要其他因子的參與。

3討論

本試驗成功從‘黃花’梨和‘綠黃花’梨中克隆到一個含有完整閱讀框的砂梨PpyHHT基因，生物信息學分析表明，PpyHHT基因編碼的氨基酸序列與薔薇科植物相似性較高(92%以上)，其中白梨最高(98%)，與其他科植物相似度較低(77%左右)。這說明PpyHHT基因屬于轉移酶類基因家族成員，同時也說明不同物種HHT氨基酸的相似度高低與物種之間的親緣關系相一致。

Lotfy等[16]研究表明HHT促進馬鈴薯組織的木栓化，也促進木栓質前體的形成[22]；木栓化組織的酶解及提取物分析表明阿魏酸及阿魏酸酯是木栓質大分子結構的主要成分[6]，因此，HHT可能是通過促進這些主成分的形成而影響木栓質的形成的。本研究顯示，‘黃花’梨在果皮色澤形成關鍵期的HHT表達量明顯高于‘綠黃花’梨，這就有可能影響木栓質成分阿魏酸等的形成，進而影響砂梨果皮褐色的形成。

本試驗克隆的2個砂梨品種(系)的PpyHHT基因的cDNA序列完全一致，從這個角度上看，‘黃花’梨的綠皮芽變‘綠黃花’梨性狀出現差異不是該功能基因發生了突變，但其基因的表達量和表達譜存在明顯差異，出現這種情況的原因：一是兩個品種(系)間調控該基因表達的調控因子如轉錄因子基因可能發生了突變。Uauy等[23]研究發現，在栽培小麥品種中轉錄因子NAM-B1基因由于1個堿基的插入引起移碼突變而喪失功能，導致營養成分的降低；二是該基因位點的啟動子區域出現了差異。Buzeli等[24]在大豆的研究中發現啟動子順式元件完整與否調控著Bip基因的表達。由此推測，‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨PpyHHT基因在轉色關鍵期的差異表達可能受上述兩個因子的影響，究竟是哪個因子在起作用還需要進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1105-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1105

收稿日期:2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-05

基金項目:國家自然科學基金(31272140)；江蘇省農業科技自主創新資金(CX(14)3009)

作者簡介:呂照清(1990-)，男，在讀碩士研究生，主要從事植物生物技術研究。E-mail:1304971536@qq.com *通信作者:喬玉山，教授，博士生導師，主要從事果樹生物技術研究。E-mail:qiaoyushan@njau.edu.cn

中圖分類號:Q78

文獻標志碼:A

Cloning and Expression ofHHTGene in ‘Huanghua’ Pear and Its Bud Mutant ‘Lühuanghua’ Pear (PyruspyrifoliaNakai)

Lü Zhaoqing,REN Dandan,ZHOU He,QIAO Yushan*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:The study used fruit peel of sand pear (Pyrus pyrifolia Nakai) cultivars ‘Huanghua’ pear (russet fruit) and its bud mutant ‘Lühuanghua’ pear (green fruit) at 8 weeks after full bloom (WAFB) as experiment materials. the cDNA full-length of HHT gene,which was named PpyHHT (GenBank accession No. KX131155), was cloned by conventional and nest PCR techniques. Sequence analysis showed that the full-length of the PpyHHT ortholog consisted of a 1 335 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide containing 444 amino acid residues. The molecular weight of deduced amino acids was 49.91 kD, with an isoelectric point (pI) of 4.75, which had the highest similarity (98%) and closest relationship with that in Pyrus bretschneideri. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) analysis demonstrated that the expression of PpyHHT gene in ‘Huanghua’ and ‘Lühuanghua’ pear peel were changing constantly during the key period (6-9 weeks), and significantly higher in ‘Huanghua’ pear peel than that in ‘Lühuanghua’. PpyHHT gene involved in the formation of sand pear russet/green traits, its expression level differences may play a role in the formation of sand pear skin color.

Key words:Pyrus pyrifolia Nakai; HHT gene; cloning; bioinformatics; gene expression