葉下珠藥材HPLC指紋圖譜的比較研究

范　適，左家哺，饒力群

(1 湖南環境生物職業技術學院 園林學院，湖南衡陽 421005；2 湖南農業大學 生物科學技術學院，長沙 410128)

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葉下珠藥材HPLC指紋圖譜的比較研究

范適1,2，左家哺1，饒力群2*

(1 湖南環境生物職業技術學院 園林學院，湖南衡陽 421005；2 湖南農業大學 生物科學技術學院，長沙 410128)

摘要:采用反相高效液相色譜法，對葉下珠藥材不同產地、不同采收期、不同部位指紋圖譜進行測定和比較分析，并與中成藥葉下珠膠囊的HPLC指紋圖譜進行了比較研究。結果顯示：(1)建立了葉下珠藥材的HPLC特征指紋圖譜，標定18個共有峰，利用對照品指認4個峰；11批(來源地不同)葉下珠樣品的HPLC圖譜相似度(相合系數，均值)在0.89～0.99之間。(2)7批不同采收期的葉下珠藥材的HPLC指紋圖譜相似度在0.94以上，各共有峰的峰面積大多隨生長期而增加，至10月5日達到最高，建議葉下珠藥材應于每年的10月上旬進行采收。(3)不同部位葉下珠藥材HPLC指紋圖譜相似度分析發現，葉、果的相似度較高(0.98～0.99)，根、莖的相似度較低(0.86～0.87)，說明根、莖中各成分含量較低，建議采收葉下珠藥材的地上部分即可。(4)比較葉下珠膠囊和葉下珠藥材的指紋圖譜，發現二者的化學成分非常相似，但峰面積差異較大，其差異可能是由于加工過程所致。該研究所建立的HPLC指紋圖譜分析方法簡便、重現性好，可用于葉下珠藥材及中成藥的鑒定與質量評價。

關鍵詞:葉下珠；HPLC；指紋圖譜

葉下珠(PhyllanthusurinariaL.)為大戟科葉下珠屬植物，別名珍珠草、夜合草、陰陽草，一年生草本，全草入藥[1]。現代藥理實驗證明葉下珠具有抗乙肝病毒和保肝護肝的藥理作用，且無毒副作用，是一種值得深入開發的天然藥物[2]。目前，對葉下珠的研究主要集中在化學成分、藥理作用及臨床應用等方面[3-7]，質量控制方面的研究較少，有文獻報道對葉下珠總黃酮[8]、生物堿[9]、總鞣質[10]、總酚[11]、沒食子酸和柯里拉京[2,12]的含量進行測定，劉慧等[13]建立了葉下珠不同產地藥材HPLC指紋圖譜，其藥材產地限于陜西、重慶、湖北三地,其分析的成分為水溶性成分，不能完全反映原藥材的特征。本文采用高效液相色譜法對葉下珠藥材不同產地、不同采收期、不同部位指紋圖譜進行了系統研究，并與中成藥葉下珠膠囊HPLC指紋圖譜[14]進行了比較研究，為葉下珠藥材及中成藥的鑒定與質量評價提供依據。

1材料和方法

1.1試驗材料

不同產地葉下珠藥材，共11批(表1)，收集時間為2005年9月～10月，采集部位為葉下珠全草。不同采收期的葉下珠藥材，共7批：于2005年7月20日至10月20日每隔15 d采收1次，采自湖南環境生物職業技術學院校園內，采集部位為葉下珠全草。不同部位葉下珠藥材，共4批：于2005年10月上旬采于湖南環境生物職業技術學院校園內，分成根、莖、葉及果4個部分。以上藥材經湖南環境生物職業技術學院高遲教授鑒定為葉下珠(PhyllanthusurinariaL .)。

表1　葉下珠藥材樣品信息表

葉下珠膠囊，共10批，由昆明四創藥業有限公司提供，批號分別為(S1～S10)：20060202B01、20060102B08、20051001B06、20050904B04、20050902B20、20050601B12、20050502B23、20050403B02、20050203B21、20050102B08。

1.2主要試劑

甲醇、乙腈(HPLC級)，購自湖南省化工研究院精細化工研究所；磷酸、醋酸、甲醇(AR級)，購自國藥集團化學試劑有限公司；對照品：葉下珠對照藥材(批號121374-200401)，沒食子酸(批號110831-200302)，柯里拉京(批號111623-200301)，購自中國藥品生物制品檢定所；原兒茶酸(批號050410)，咖啡酸(批號110885-200102)，購自上海友思生物技術有限公司。

1.3主要儀器

島津LC-VP系列高效液相色譜儀(包括DAD檢測器、二元泵、Class-VP工作站,日本島津公司)；色譜柱Hypersil ODS2 250 mm×4.60 mm，5 μm 粒徑(購自大連化物所)；Sartorius CP225D電子天平(德國賽多利斯公司)；KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EASYpure II RF/UV型Barnstead超純水處理器(美國賽默飛世爾)。

1.4試驗方法

1.4.1色譜條件(1)葉下珠藥材色譜柱Hypersil ODS2(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動相采用乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)二元系統梯度洗脫：0～10 min A由3%升至11%，10～30 min由11%升至13%，30～45 min由13%升至20%，45～55 min由20%升至30%，55～65 min由30%升至50%，65～70 min由50%降至3%；柱溫25 ℃；流量0.8 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

(2)葉下珠膠囊色譜柱Hypersil ODS2(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動相采用乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)二元系統梯度洗脫：0～10 min A由3%升至11%，10～30 min由11%升至13%，30～45 min由13%升至21%，45～55 min由21%升至31%，55～65 min由31%升至50%；柱溫35 ℃；流量0.8 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

1.4.2參照物溶液的制備精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸和柯里拉京對照品適量，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，濃度分別為0.085、0.075、0.080、0.076 mg/mL，備用。

1.4.3供試品溶液的制備葉下珠藥材：葉下珠藥材樣品45 ℃烘干，磨成細粉，過60目篩，精密稱取樣品細粉250 mg，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇15 mL稱質量，回流提取1.0 h，取出放冷，稱質量，用50%甲醇補足減失的質量，過濾, 取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

葉下珠膠囊：精密稱取葉下珠膠囊樣品250 mg，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL稱質量，回流提取1.0 h，取出放冷，稱質量，用50%甲醇補足減失的質量，過濾，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.4.4方法學驗證(1)精密度試驗同一批樣品(1號，產地為湖北武昌)按“1.4.1”項下色譜條件，連續進樣5次，測定指紋圖譜，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

(2)穩定性試驗同一批樣品(1號，產地為湖北武昌)按“1.4.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24 h測定指紋圖譜，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

(3)重現性試驗取同一批樣品(1號，產地為湖北武昌)按“1.4.3”項下方法制備5份供試液，按“1.4.1”項下色譜條件測定指紋圖譜，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

1.4.5指紋圖譜相似度評價及聚類分析采用“計算機輔助相似性評價系統”軟件進行指紋圖譜相似度評價(版本1.315，中南大學中藥現代化研究中心梁逸曾教授提供)，采用SPSS 20.0統計分析軟件進行聚類分析。

2結果與分析

2.1方法學驗證

2.1.1精密度試驗同一批樣品按“1.4.1”項下色譜條件，連續進樣5次，測定指紋圖譜，結果以8號峰(柯里拉京)為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.36%，相對峰面積的RSD為0.11%～1.99%，表明儀器系統精密度良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.1.2穩定性試驗同一批樣品按“1.4.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24 h測定指紋圖譜，結果以8號峰(柯里拉京)為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.11%～0.49%，相對峰面積RSD為0.15%～2.20%，表明供試品溶液在24 h內穩定，符合指紋圖譜的技術要求。

2.1.3重現性試驗取同一批樣品按“1.4.3”項下方法制備5份供試液，按“1.4.1”項下色譜條件測定指紋圖譜，結果以8號峰(柯里拉京)為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.59%，相對峰面積RSD為0.18%～2.66%，表明該方法重現性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.2不同產地葉下珠藥材HPLC指紋圖譜

取11批葉下珠藥材，按照“1.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.4.1”項下色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜。

2.2.1共有峰的確定根據11批葉下珠藥材高效液相分析，確定18個共有峰，構建了葉下珠HPLC色譜圖的特征指紋圖譜(圖1)。根據對照品保留時間指認了其中的的4個峰：2號峰為沒食子酸，3號峰為原兒茶酸，6號峰為咖啡酸，8號峰為柯里拉京(圖1)。由于8號峰柯里拉京峰面積較大，出峰時間適中，因此，選擇8號峰為參照峰，標記為S。計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2和表3。統計各批樣品的18個共有峰面積占總峰面積比，結果為90.5%～95.8%(表4)，符合指紋圖譜的技術要求。

2.2.2相似度計算及對照指紋圖譜的生成經實驗得到11批葉下珠藥材指紋圖譜(圖3)。采用中位數法和均值法生成對照圖譜，采用相關系數法和相合系數法分別計算各批次與對照圖譜的相似度，結果見表5。

2.2.3不同產地葉下珠藥材指紋圖譜相似度評價11批葉下珠藥材相似度在0.838 7～0.985 2(相關系數，中位數法)、0.845 3～0.985 3(相關系數，均值法)、0.884 7～0.989 0(相合系數，中位數法)、0.893 3～0.988 3(相合系數，均值法)，說明本實驗建立的葉下珠藥材指紋圖譜18個共有峰以及對照指紋圖譜可反映其指紋特征，具有鑒定評價意義。其中，8號藥材(產地為云南昆明)相似度較低，無論采用哪種相似度評價方法，其相似度都在0.9以下，可能與其產地云南昆明的獨特氣候條件有關。

2.2.4不同產地葉下珠藥材指紋圖譜聚類分析將11批不同產地葉下珠藥材樣品各峰的相對峰面積值導入SPSS 20.0軟件，選用ward法聚類方法，歐式距離為度量標準，聚類分析結果見圖2。從樹狀聚類圖中看到，11批樣品大致可分為三類(距離為8)，與指紋圖譜相似度存在相關性。第一類由2、4、7、10號樣品組成，從指紋圖譜相似度來看(相關系數、中位數)，四批樣品的相似度都較高，在0.966 2～0.983 9之間；從產地來看，2、10號樣品都來自廣東，7號樣品來自江西，4號樣品為對照藥材，說明廣東、江西的藥材及對照藥材質量較好。第二類由1、3、8、11號樣品組成，1、11號樣品相似度較高，在0.95以上(相關系數、中位數)，產地為地理位置上緊鄰的湖北、湖南，3、8號樣品相似度較低，分別為0.885 9、0.838 7(相關系數、中位數)，產地為浙江、云南。第三類由5、6、9號樣品組成，相似度都不高，在0.887 7～0.946 3之間(相關系數、中位數)，產地為廣西、海南及湖南邵陽廉橋藥材市場。

C.混合對照品；S.葉下珠藥材；2.沒食子酸；3.原兒茶酸；6.咖啡酸；8.柯里拉京圖1　混合對照品色譜圖和葉下珠特征指紋圖譜C. Mixture of reference substances; S. P. urinaria L.; 2. Gallic acid; 3. Protocatechuic; 6. Caffeic acid; 8. CorilaginFig. 1　HPLC fingerprint of mixture of reference substances and representative HPLC fingerprint of P. urinaria L.

峰號Peaknumber樣品編號Samplenumber1234567891011平均值Average10.1230.1240.1230.1230.1240.1240.1230.1230.1240.1230.1230.12320.3190.3170.3160.3160.3170.3170.3180.3150.3170.3160.3180.31730.4470.4440.4450.4450.4450.4450.4450.4450.4450.4460.4450.44540.5630.5610.5620.5610.5620.5620.5610.5610.5620.5620.5610.56250.6520.6500.6510.6520.6470.6540.6530.6490.6490.6520.6480.65160.8240.8300.8240.8240.8210.8270.8240.8290.8320.8230.8380.82770.9830.9810.9840.9810.9810.9820.9840.9800.9820.9820.9810.9828(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00091.1511.1481.1491.1481.1501.1501.1481.1471.1491.1531.1481.149101.2941.2981.2901.2911.2921.2921.2931.2931.2951.2911.2951.293111.4181.4081.4151.4091.4091.4111.4081.4211.4131.4071.4121.412121.4321.4261.4261.4271.4281.4361.4271.4261.4281.4221.4331.428131.4851.4731.4731.4721.4761.4761.4751.4731.4781.4761.4721.475141.5151.5091.5091.5131.5151.5051.5061.5111.5141.5241.5061.512151.5821.5701.5731.5731.5761.5821.5781.5801.5731.5811.5721.576161.6191.6281.6181.6181.6221.6221.6151.6251.6221.6111.6241.620171.6411.6331.6471.6381.6351.6381.6471.6331.6431.6341.6451.639181.6811.6721.6811.6801.6771.6731.6791.6871.6841.6831.6861.680

表3　11批葉下珠藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積

表4　11批葉下珠藥材共有峰面積占總峰面積比

圖2　不同產地葉下珠藥材HPLC指紋圖譜聚類分析樹狀圖Fig. 2　Hierarchical clustering analysis of P. urinaria L. from different habitats

2.3不同采收期葉下珠藥材HPLC指紋圖譜

2.3.1相似度評價7批不同采收時間的葉下珠藥材的HPLC指紋圖譜見圖4，相似度評價結果見表6，從表6可以看出，7批不同采收時間的葉下珠藥材其相似度在0.948 3～0.996 3，無論采用哪種相似度評價方法，其相似度都在0.94以上，說明樣品之間具有較高的相似度。

1～11為葉下珠不同產地藥材樣品編號;R為對照圖譜(紅色：均值法；藍色：中位數法)圖3　不同產地葉下珠藥材HPLC指紋圖譜疊加圖1 to 11 is sample number of P. urinaria L. from different habitats; R is control fingerprint(red: average method; blue: median method)Fig. 3　Superimposed HPLC fingerprint of P. urinaria L. from different habitats

1. 7月20日；2. 8月5日；3. 8月20日；4. 9月5日；5. 9月20日；6. 10月5日；7. 10月20日；R為對照圖譜(紅色：均值法；藍色：中位數法)圖4　不同采收期葉下珠藥材HPLC指紋圖譜疊加圖1. 20 July; 2. 5 August; 3. 20 August; 4. 5 September; 5. 20 September; 6. 5 October; 7. 20 October; R is control fingerprint(red: average method; blue: median method)Fig. 4　Superimposed HPLC fingerprint of P. urinaria L. in different harvest times

2.3.2不同采收期葉下珠藥材指紋圖譜比較比較共有峰在不同采收期的峰面積，可以發現，共有峰的峰面積(即成分的含量)大多隨生長期而增加，至10月5日達到最高，過后則明顯降低(圖6)。葉下珠藥材傳統的采收期為夏秋[1]，從不同采收期的指紋圖譜來看，建議葉下珠藥材的采收期為每年的10月上旬。

表5　不同產地葉下珠藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結果

表6　不同采收期葉下珠藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結果

注：1～7號樣品同圖4

Note: Sample 1～7 are the same as that of Figure 4

表7　不同部位葉下珠藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結果

2.3.3不同采收期葉下珠藥材指紋圖譜聚類分析將7批不同采收期葉下珠藥材樣品各峰的相對峰面積值導入SPSS 20.0軟件，選用ward法聚類方法，歐式距離為度量標準，聚類分析結果見圖5。從樹狀聚類圖中看到，7批樣品大致可分為四類(距離為4)，與樣品的采收期、各共有峰峰面積(各成分含量)及指紋圖譜相似度存在相關性。第一類由采收期為7月20日、8月5日的1、2號樣品組成，第二類由采收期為8月20日、9月5日、9月20日的3、4、5號樣品組成，第三類為采收期10月5日的6號樣品，第四類為采收期10月20日的7號樣品。第一類的1、2號樣品、第二類的3、4、5號樣品其采收期相近、各共有峰峰面積及指紋圖譜相似度也相近，第三類的6號樣品、第四類的7號樣品，由于其各共有峰峰面積較高，與其它樣品差異明顯，因此單獨列為一類，這與圖5的分析結果“共有峰的峰面積大多隨生長期而增加，至10月5日達到最高，過后則明顯降低”一致。從指紋圖譜相似度結果來看(表6)，采收期為10月5日的6號樣品的相似度最低，主要是由于其大多數共有峰峰面積在采收期10月5日時達到最高(圖6)，明顯高于其它樣品，從而導致指紋圖譜相似度較低，因此6號樣品單獨列為一類，與指紋圖譜相似度分析結果一致。

圖5　不同采收期葉下珠藥材HPLC指紋圖譜聚類分析樹狀圖Fig. 5　Hierarchical clustering analysis of P. urinaria L. from different harvest times

1～16.峰號圖6　不同采收期葉下珠藥材部分共有峰峰面積比較1-16.Peak numberFig. 6　Comparison of some mutual peak of P. urinaria L. in different harvest times

X.葉下珠膠囊(S7號樣品)；Y.葉下珠藥材(4號樣品)；3.沒食子酸；4.原兒茶酸；8.柯里拉京圖8　葉下珠膠囊和葉下珠藥材的特征HPLC圖譜比較X. YeXiaZhu Capsules(sample S7); Y. P. urinaria L.(sample 4); 3. Gallic acid; 4. Protocatechuic; 8. CorilaginFig. 8　Comparison of representative HPLC fingerprint of YeXiaZhu Capsules and P. urinaria L.

A.根;B.莖;C.葉;D.果圖7　不同部位葉下珠藥材HPLC指紋圖譜疊加圖A.Root; B.Stem; C.Leaf; D.FruitFig. 7　Superimposed HPLC fingerprint of P. urinaria L. from different parts

2.4不同部位葉下珠藥材HPLC指紋圖譜

2.4.1相似度評價葉下珠藥材不同部位的HPLC指紋圖譜見圖7，相似度評價結果見表7，從表7可以看出，葉、果相似度較高，都在0.948 6以上，根、莖的相似度較為接近，莖的相似度在0.832 9～0.914 4，根的相似度最低，在0.842 3～0.883 8，它們在相似度上的差異有兩方面的原因，一是各成分在含量上的差異，二是部分共有峰如1和14號峰在根的樣品中沒有出現，導致根的相似度較低。

2.4.2不同部位藥材指紋圖譜比較由圖7可知，葉下珠不同部位的HPLC圖譜基本一致，如1、2、3、6、7、8、9、10、12、16、17、18號峰都能在藥材不同部位的圖譜中找到，但峰面積的差別很大，各共有峰峰面積最高是葉，其次為果、莖，最低是根，且葉中各共有峰峰面積較其它部位高出很多，例如，2號峰(沒食子酸)，葉片中最高，果次之，根、莖最低，約為葉的1/5；3號峰(原兒茶酸)，葉中很高，其它部位僅是痕量或幾乎沒有；8號峰(柯里拉京)為葉下珠主要活性成分之一[2]，葉片中最高，根中最低，約為葉的1/5。在根中，保留時間65 min處有一特征峰。

2.5葉下珠膠囊與葉下珠藥材的特征指紋圖譜比較

對葉下珠膠囊的特征指紋圖譜[14]和葉下珠藥材的特征指紋圖譜進行了對比分析(圖8)，由圖8可知，葉下珠膠囊與葉下珠對照藥材的化學成分非常相似，葉下珠藥材的指紋峰基本上在葉下珠膠囊中都能找到，兩者的差異主要體現在3號、5號、8號、9號、11號及16號峰的峰面積上。11號峰在葉下珠膠囊中存在，但葉下珠藥材中沒有；3號(沒食子酸)、5號和8號峰(柯里拉京)的峰面積葉下珠膠囊比葉下珠藥材高出很多，特別是3號峰，兩者的峰面積相差10倍以上，但是9號、16號峰的峰面積比葉下珠藥材低。

3討論

3.1葉下珠藥材的HPLC指紋圖譜

根據11批供葉下珠藥材確定18個共有峰構成葉下珠藥材的特征指紋圖譜，根據對照品保留時間指認了其中的4個共有峰：2號峰沒食子酸，3號峰原兒茶酸，6號峰咖啡酸，8號為柯里拉京，選擇8號峰為參照峰，采用計算機輔助的相似度評價軟件進行相似度評價，其相似度在0.89～0.99范圍內(相合系數，均值)，達到相似度的基本要求。因此，本試驗建立的葉下珠藥材HPLC指紋圖譜能夠用于葉下珠藥材的鑒定及質量評價。根據聚類分析結果，11批不同產地藥材可分為3類，廣東、江西的藥材及對照藥材歸為一類，其指紋圖譜相似度較高，說明產地為廣東、江西的藥材及對照藥材質量較好。

3.2葉下珠藥材的采收時期

從葉下珠藥材不同采收期的指紋圖譜來看，各共有峰的峰面積(即成分的含量)大多隨生長期而增加，至10月5日達到最高，過后則明顯降低，建議葉下珠藥材的采收期為每年的10月上旬。

3.3葉下珠藥材的采收部位

對不同部位葉下珠藥材HPLC指紋圖譜相似度進行分析，發現葉、果的相似度較高，在0.98～0.99之間(相合系數，均值)，根、莖的相似度較低，在0.86～0.87之間(相合系數，均值)，原因在于根、莖中各成分含量較低。葉下珠藥材的藥用部位是全草，其根、莖、葉、果的比例大體上是根占10～20%，莖占40～50%，葉占30～40%，果所占的比例較小，約占5%，地上部分莖、葉、果加起來所占比例在80%以上，根所占比例不到20%，且各成分含量又很低，因此，從各部位的指紋圖譜及所占比例分析，建議只采收葉下珠藥材的地上部分。

3.4葉下珠膠囊與葉下珠藥材在指紋圖譜上的差異

葉下珠膠囊是單味植物藥，其加工工藝[15]為“取葉下珠粗粉5 000 g，用10倍量80%乙醇分3次浸漬，每次16 h，濾過，濾液回收乙醇，濃縮成相對密度為1.20～1.25(40 ℃)的清膏，加6倍量水沉淀，取上清液，減壓濃縮至相對密度為1.30～1.35(40 ℃)的稠膏，加入葉下珠200 g細粉，混勻，干燥，粉碎，過篩，裝入膠囊，即得”，該工藝采用浸漬提取法，不會破壞化學成分的結構，因而，葉下珠膠囊與葉下珠藥材的化學成分非常相似，葉下珠膠囊采用醇提水沉法，以沉淀方式除去樹脂、葉綠素等脂溶性雜質，使有效成分進一步富集，因此，一些指紋峰如3號峰(沒食子酸)和8號峰(柯里拉京)，其峰面積高出葉下珠藥材數倍以上，因此，葉下珠膠囊與葉下珠藥材在指紋圖譜上的差異是由于其加工過程所致。

參考文獻:

[1]全國中草藥匯編編寫組. 全國中草藥匯編(上冊)[M].北京:人民衛生出版社，1978:263.

[2]范適. 葉下珠保肝護肝有效成分的分離及HPLC指紋圖譜研究[D].長沙：湖南農業大學，2007.

[3]仲英, 左春旭, 李風琴,等. 葉下珠化學成分及其抗乙肝病毒活性的研究[J]. 中國中藥雜志，1998,23(6): 363-364.

ZHONG Y, ZUO C X, LI F Q,etal. Studies on chemical constituents ofPhyllanthusurinariaL. and its antiviral activity against hepatitis B virus[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 1998,23(6): 363-364.

[4]SYAMASUNDAR KV, SINGH B, THAKUR RS,etal. Antihepatotoxic principles ofPhylantusniruriherbs[J].Ethnoparmacol, 1985,14(1): 41.

[5]周世文, 徐傳福, 周寧,等. 葉下珠對小鼠實驗性肝損傷的保護作用[J]. 中藥材, 1994, 17(12): 31-32.

ZHOU S W,XU C F, ZHOU N,etal.Studies on protective effects ofPhyllanthusurinariaL. on experimental liver injury in mice[J].JournalofChineseMedicinalMaterials, 1994, 17(12): 31-32.

[6]范適, 李蘭嵐, 饒力群,等.抗乙肝植物藥葉下珠化學成分和藥理作用研究進展[J].南華大學學報:自然科學版, 2006,20(2):83-87.

FAN S,LI L L, RAO L Q,etal.Advance in study of chemical constituents and pharmacological effect ofPhyllanthusurinariaL. against HBV[J].JournalofNanhuaUniversity(Science and Technology). 2006,20(2):83-87.

[7]任麗娟. 葉下珠屬植物化學成分研究和臨床應用[C]. 全國植物資源和植物化學學術討論會論文摘要集,1995: 11-15.

[8]牛曉峰,趙銳山,李維鳳,等.葉下珠不同生長期及貯存期總黃酮含量測定[J].西北藥學雜志, 2000, 15(2):60.

NIU X F, ZHAO R S, LI W F,etal.Determination of total flavonoids in different growth period and storage period ofPhyllanthusurinariaL.[J].NorthwestPharmaceuticalJournal, 2000, 15(2):60.

[9]鄧光輝,胡煒,劉榕城,等.溴麝香草酚藍比色法測定葉下珠生物堿的含量[J].時珍國醫國藥,2009,20(5):1 193-1 194.

DENG G H, HU W, LIU R Cetal. Determination of alkaloids ofPhyllanthusurinariaL. in bromothymol colorimetric method[J].LishizhenMedicineandMateriaMedicaResearch, 20(5):1 193-1 194.

[10]牛曉峰,李維鳳,李延.葉下珠不同生長期及保存期總鞣質含量測定[J].西北藥學雜志,2000,15(增刊): 14.

NIU X F, LI W F, LI Y. Determination of total tannide in different growth period and storage period ofPhyllanthusurinariaL.[J].NorthwestPharmaceuticalJournal, 2000, 15(Suppl.):14

[11]王坤鳳,林琛,吳玲芳,等.不同產地葉下珠藥材中總酚含量測定[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(13):110-112.

WANG K F, LIN C, WU L F,etal. Determination of total phenols fromPhyllanthusurinariain different locations[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae,2013,19(13):110-112.

[12]范適,左家哺,易誠,等.HPLC法同時測定葉下珠膠囊中沒食子酸和柯里拉京的含量[J].湖南農業大學學報：自然科學版，2007，33(5):636-638.

FAN S, ZUO J P, YI C,etal. Determination of contents of gallic acid and corilagin in Yexiazhu Capsules by HPLC[J].JournalofHunanAgriculturalUniversity(Natural Sciences), 2007, 33(5):636-638.

[13]劉慧, 盛衛國, 彭松. 葉下珠藥材HPLC指紋圖譜的研究[J]. 中藥材, 2007, 30(2):150-154.

LIU H, SHENG W G, PENG S. Study on HPLC Finger prints ofPhyllanthusurinaria[J].JournalofChineseMedicinaMaterials, 2007, 30(2):150-154.

[14]范適, 左家哺, 易誠,等. 葉下珠膠囊的HPLC指紋圖譜研究[J].湖南中醫藥大學學報, 2008, 28(1): 35-37,40.

FAN S, ZUO J P, YI C,etal. Study on fingerprints of Yexiazhu Capsules by HPLC[J].JournalofTCMUniv.ofHunan, 2008, 28(1): 35-37,40.

[15]國家食品藥品監督管理局. 中華人民共和國國家藥品監督管理局標準(試行)[S]. WS-11435(ZD-1435)-2002.

(編輯:潘新社)

文章編號:1000-4025(2016)06-1206-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1206

收稿日期:2016-01-18;修改稿收到日期:2016-06-05

基金項目:湖南省教育廳青年基金(04B018)；衡陽市科技計劃(2007KJ014)

作者簡介:范適(1969-)，男，博士，副教授，主要從事植物天然產物的研究與利用。E-mail:593077425@qq.com *通信作者:饒力群，教授，博士生導師，主要從事植物天然產物的研究與開發。E-mail:raoliqun@163.com

中圖分類號:Q503

文獻標志碼:A

Comparative Study on HPLC Fingerprint ofPhyllanthusurinaria

FAN Shi1,2, ZUO Jiapu1, RAO Liqun2*

(1 Landscape Department, Hunan Polytechnic of Environment and Biology, Hengyang, Hunan 421005, China；2 College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Abstract:The HPLC fingerprint of Phyllanthus urinaria from different habitats, different harvest times, different parts was determined and compared by RP-HPLC. The comparative study was done with the HPLC fingerprint of Yexiazhu Capsules also. The representative HPLC fingerprint of P. urinaria was established. The results showed: (1) There were 18 mutual peaks, four of which were identified by reference substance. The similarity of 11 samples from different habitats was in the range of 0.89 to 0.99. (2) The similarity of 7 samples from different harvest times was greater than 0.94. The peak area of most mutual peaks increased with growth period, the highest was in 5 October. It was suggested the best harvest time was on early October annually. (3) The similarity of samples from different parts was analyzed and evaluated. The similarity of leaf and fruit was higher in the range of 0.98 to 0.99, and the similarity of root and stem was in the range of 0.86 to 0.87. Lower content of components in root and stem brought about the difference in similarity. It was suggested only collecting the aerial parts. (4) The chemical constituents of Yexiazhu Capsules were nearly consistent with that of reference herb of P. urinaria, but the peak area of some peaks varied very much because of processing of Yexiazhu Capsules. So, this method is simple, accurate, and reproducible, which can be used for the quality control and evaluation of P. urinaria and its Chinese proprietary medicines.

Key words:Phyllanthus urinaria L.; high performance liquid chromatography; fingerprint