龍眼DlPPO1基因的克隆及其表達調控分析

田奇琳，林玉玲，鄭慶游，蘇榮峰，賴鐘雄

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

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龍眼DlPPO1基因的克隆及其表達調控分析

田奇琳，林玉玲，鄭慶游，蘇榮峰，賴鐘雄*

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

摘要:該研究根據同源克隆技術，利用RT-PCR和RACE技術，以‘四季蜜’龍眼葉片cDNA為模板，獲得龍眼多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase，PPO)的3個轉錄本DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的cDNA全長序列(KM387405、KM516087和KM516088)和1條DNA序列DlPPO1(KU837229)。DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的全長分別為1 969、1 960和1 920 bp，包含相同的完整開放閱讀框1 800 bp并編碼599個氨基酸；該基因與荔枝、橄欖和棗等物種的PPO基因同源性較高。生物信息學分析表明，DlPPO1保守結構域具有多酚氧化酶的典型結構域特征。利用實時熒光定量PCR技術檢測DlPPO1表達結果表明，在龍眼體胚發生過程中，DlPPO1從心形胚時期開始上調表達至子葉胚時期達到最高，推測其在龍眼體胚發生中后期可能發揮重要作用； DlPPO1在龍眼葉片中表達量最高，其次是花芽，而在其他組織部位表達量較低。激素和非生物脅迫處理下的表達分析表明，水楊酸(SA)、低濃度茉莉酸甲酯(MeJA)、NaCl、甘露醇及PEG可誘導DlPPO1基因上調表達，這些表達模式暗示其可能參與多種非生物脅迫應答過程。

關鍵詞:龍眼；體細胞胚胎發生；多酚氧化酶；非生物脅迫；實時熒光定量PCR

多酚氧化酶又叫做兒茶酚酶、酪氨酸酶、綠原酸酶和漆酶等，大體上分成兩類：兒茶酚氧化酶和漆酶，習慣上把兒茶酚氧化酶稱為多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)，它與漆酶(p-diphenol oxadise 或 Laccase)有明顯的區別[1]。PPO是一類由核編碼且結合銅離子的結構蛋白，催化單元酚、雙元酚等多元酚氧化成醌類，普遍存在于動植物、真菌和細菌中。PPO對植物的生長發育具有重要的意義，如促進乙烯代謝過程[2]；而且PPO在植物組織和器官中的分布具有時空特異性，如在番茄中，PPOB基因在大多數組織的維管和里層中表達量高，且在幼嫩組織中表達量高且隨著植株的發育表達量降低，而在小麥中，PPO基因在胚芽鞘和胚根中表達強烈[1-2]。PPO可催化木質素和醌類化合物的生成，構成保護性屏障而使細胞免受或減輕病菌病蟲的侵害，在植物逆境防御中起著重要作用[3-4]；逆境脅迫或病原體侵染等外界因素誘導植物產生PPO活性，其中也涉及到茉莉酸等激素信號途徑在植物防御反應中的作用[5]。在植物體內，miRNA 通過調節相應的靶基因來控制植物參與環境脅迫的響應，PPO則是受到miR1444a調控的靶基因，參與楊樹對環境脅迫的應答響應[6]。

近年來PPO的研究已經成為熱點，許多熱帶南亞熱帶木本果樹(如龍眼、荔枝、橄欖等)，在果實貯藏保鮮及組織培養過程中容易發生褐變，而多酚氧化酶的酶促反應是影響褐變的主要原因[7-8]。龍眼果皮褐變和果肉自溶等問題是導致龍眼采后難以長期貯存的重要原因，關于龍眼果皮和果肉等組織的多酚氧化酶活性研究已有報道，如經50 ℃熱水處理10 min可有效降低果皮PPO活性，保持較高的果皮總酚含量，可有效降低采后龍眼果實酚類物質代謝，從而延緩采后龍眼果實果皮褐變的發生；PPO酶等同工酶也與龍眼果實自溶的發生和發展密切相關[9-10]。許多植物PPO的研究主要集中在酶學特性上[11-12]，其生理機制尚不明確，近年來許多植物尤其是果樹PPO基因已經得到克隆[13-16]，但植物PPO在生長發育過程和逆境脅迫表達調控機制方面的研究還很少。榮霞分離獲得橄欖PPO基因并發現該基因在橄欖試管苗生長發育過程中發揮重要作用，可能與幼嫩組織的啟動分化有關[15]；王家保等分離獲得荔枝PPO基因，且檢測到該基因在果實采后貯藏早期果皮中上調表達,可能提高PPO活性從而加劇荔枝果實采后過程中的果皮褐變[16]。植物胚胎發育過程的遺傳調控可以作為探索植物發育過程中形態發生規律及控制機理的基礎手段，且龍眼中PPO基因的克隆及表達調控機制未見報道，因此本研究利用龍眼體胚發生系統[17]，分離、鑒定一個完整的PPO基因，并對其在龍眼體胚發育過程、不同組織器官、以及逆境脅迫處理下過程中的差異表達進行分析，以期為探索多酚氧化酶與龍眼生長發育及逆境脅迫響應之間的關系提供線索。

1材料和方法

1.1材料

以‘四季蜜’品種龍眼的葉片作為基因克隆的材料，以 ‘紅核子’ 品種[17]龍眼胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚以及‘四季蜜’品種[18]龍眼的根、葉、花和果實等為用于檢測基因在龍眼組織不同部位的差異表達材料。對培養18 d的龍眼胚性愈傷組織進行茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)兩種激素處理：200 mL錐形瓶中加入40 mL MS(蔗糖20 g/mL)液體培養基，液體培養基內依次添加一種激素至終濃度依次為：0、25、50、75和100 μmol/L，3次重復，選取松散、淺黃且顆粒較細的龍眼愈傷大約0.5g輕輕放入培養基中，將錐形瓶置于搖床110 r/min，25 ℃，黑暗培養24 h。脅迫因素處理：200 mL錐形瓶中加入40 mL MS(蔗糖20 g/mL)液體培養基，液體培養基內各添加NaCl(150 mmol/L)、甘露醇(150 mmol/L)、PEG-4000(10%)和ABA(10 μmol/L)，3次重復后選取松散、淺黃且顆粒較細的龍眼愈傷大約0.5 g輕輕放入培養基中，將錐形瓶置于搖床110 r/min，25 ℃，黑暗培養1、2、4、8、12、16和24 h后，分別收集以上處理材料用于RNA提取和定量表達分析。

1.2方法

1.2.1DNA和總RNA提取及cDNA合成采用改良CTAB法[19]提取DNA，采用TriPure(Roche)試劑盒提取總RNA，并采用GeneRacer Kit(Invitrogen)進行RT-PCR反轉錄。qPCR的cDNA合成采用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa)，具體方法參照說明書。

1.2.2引物設計與PCR擴增根據GenBank報道的PPO氨基酸保守序列和核酸序列分別設計同源克隆引物DlPPO1-F1和簡并引物DlPPO1-R1進行DlPPO1部分cDNA序列的擴增，并根據擴增得到的部分cDNA序列設計RACE引物，用于擴增DlPPO1基因cDNA 3′末端和5′末端序列；根據獲得的3′末端和5′末端序列設計引物，進行DlPPO1基因開放閱讀框的擴增。研究中所用的引物名稱及序列見表1，引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR 反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35 個循環；72 ℃延伸6 min。

1.2.3目的片段的回收PCR 擴增產物經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶采用BIOMIGA公司 DNA快速純化回收試劑盒進行回收，采用pMD18-T Vector(Takara Biotechnology)或者pEASY-T5 Zero Cloning Kit(TransGen Biotech)進行目的片段的克隆。陽性克隆子的測序委托上海博尚生物技術有限公司完成。

1.2.4生物信息學分析采用NCBI的Blast和DNAMAN 6.0對獲得的基因全長序列進行分析。DlPPO1蛋白的生物信息學分析，采用以下分析工具進行：蛋白質基本理化性質的分析(ExPASy Protparam, http://web.expasy.org/protparam/),信號肽預測(SignalP 4.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，亞細胞定位預測(PSORT, http://psort. hgc.jp/)，蛋白質跨膜結構的預測(EMBnet TMpred, http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html)，磷酸位點預測(NetPhos 2.0 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)，蛋白質保守結構域預測(NCBI-ProteinTools, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，蛋白質二級結構預測(PSIPRED Protein Structure Prediction Server, http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/)，蛋白質三級結構預測(SWISS-MODEL, http://swissmodel.expasy.org/)，分子系統進化樹的構建(Mega 5)。

1.2.5實時熒光定量PCR分析實時熒光定量PCR(qPCR)反應參照Lin和Lai[20]的步驟進行，儀器為LightCycler 480(Roche Applied Science, Switzerland)。反應體系：2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)10 μL，cDNA 1 μL，引物(DlPPO1-QF、DlPPO1-QR)各0.8 μL，總共體積20 μL。qPCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；通過熔解曲線分析確定擴增反應的特異性。以eIF4A、EF-1A和Fe-SOD為內參基因[20]。

表1　DlPPO1基因克隆和qPCR引物列表

2結果與分析

2.1龍眼DlPPO1基因cDNA全長序列的獲得

以龍眼葉片cDNA為模板，以DlPPO1-F1和DlPPO1-R1為引物擴增獲得1 137 bp的序列，經NCBI的Blast比對推測該序列為龍眼PPO基因保守區部分序列，再根據獲得的序列設計RACE引物，獲得PPO基因的5′末端序列和3′末端序列，并在其5′末端和3′末端序列設計特異性引物DlPPO1-CF1和DlPPO1-CR1進行ORF驗證，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA，開放閱讀框(ORF)長為 1800 bp，編碼599個氨基酸；DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的5′端非編碼區(5′-UTR)相同，長度為32 bp，3′非編碼區(3′-UTR)長度不同，分別為137、128和88 bp， 且polyA長度分別為20、28和23 bp。將該序列推導的編碼區氨基酸序列在NCBI進行比對，發現DlPPO1與其他植物如荔枝、橄欖、胡楊等的PPO基因高度同源，其中與荔枝的一致性最高，達94%。經結構域分析推測該基因為龍眼PPO基因，該基因3個轉錄本序列在GenBank中登錄，分別命名為DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c，登錄號分別為KM387405、KM516087和KM516088。以‘四季蜜’龍眼葉片DNA為模板，以DlPPO1-CF1和DlPPO1-CR1為引物擴增獲得1條長度為2 163 bp DNA序列，命名為DlPPO1(GenBank登錄號KU837229)；DlPPO1基因僅含有1個內含子，長度為214 bp。

2.2生物信息學分析

2.2.1龍眼DlPPO1蛋白基本性質分析采用ExPASy中的蛋白質基本參數分析工具 ProtParam 對DlPPO1基本參數進行計算表明，DlPPO1編碼的蛋白為堿性蛋白，具有親水性，且帶正電氨基酸數量(Arg+Lys)均大于帶負電的氨基酸數量(Asp+Glu)；DlPPO1是不穩定蛋白。采用SignalP 4.1 Server預測表明DlPPO1不含信號肽，不是分泌蛋白。采用PSORT分析顯示DlPPO1蛋白定位于葉綠體基質的可能性最大，分值為0.892。在亞細胞定位分析的基礎上，利用ExPASy中的TMpred工具進行跨膜結構的預測顯示，DlPPO1具有跨膜結構域，可能與膜定位和跨膜轉運有關。磷酸化位點預測顯示，DlPPO1蛋白共含35個磷酸化位點，其中絲氨酸的磷酸化位點21個，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點分別為8個和6個，DlPPO1蛋白中絲氨酸的比例明顯大于蘇氨酸和酪氨酸。對DlPPO1蛋白的二級結構進行預測，其中無規則卷曲所占比例最大，而α螺旋和β折疊所占比例相當；在了解蛋白二級結構的基礎上，進一步對其三級結構進行預測，預測的結果與二級結構預測的結論相符。使用NCBI-CD-Search工具進行蛋白保守區域分析，結果顯示DlPPO1氨基酸序列中173-382區域與酪氨酸酶超家族的核心序列高度同源，具有PPO蛋白的典型特征，含PPO1_DWL和PPO1_KFDV兩個結構域(圖1)。

2.2.2龍眼DlPPO1基因相關MicroRNA預測與分析miRNAs作為一種調節分子，參與控制植物的生長發育和逆境脅迫應答。已有研究表明miRNAs在植物花、種子、葉、根和維管等形態建成和發育中均發揮重要作用；且miRNAs除了可以響應激素信號調控并參與控制其他miRNAs的生物合成，還可以通過應答干旱脅迫、病毒侵染等逆境脅迫調控基因表達。因此，研究miRNAs對靶基因的調控作用，對于研究靶基因如何參與植物生長發育調控及環境脅迫響應有重要意義。利用在線軟件psRNA Target等[21]對調控DlPPO1的miRNAs進行預測，結果在楊樹miRNA數據庫中比對發現DlPPO1存在楊樹miR1444(ptc-miR1444)的翻譯抑制位點，說明在龍眼DlPPO1可能也存在與ptc-miR1444類似抑制位點，受到龍眼中類似miRNA成員的調控。

2.2.3系統進化樹分析系統進化分析表明，龍眼DlPPO1與同科的荔枝(JF926153.1)PPO距離較近，與木犀科植物橄欖(JQ319005.1)、鼠李科植物棗(HQ634289.1)和蕓香科植物甜橙(XM_006468155.1)等的PPO的遺傳距離也較近(圖2)。

2.3龍眼體胚發生過程中DlPPO1基因表達模式

植物基因在胚胎發育過程的轉錄水平變化可為探索其在植物發育過程中的調控機制提供線索。DlPPO1基因在龍眼體胚發生不同時期(胚性愈傷組織、不完全緊實結構、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚)的相對轉錄水平進行分析，結果表明，從胚性愈傷組織時期到心形胚時期的DlPPO1基因的轉錄水平一直相對較低，而從心形胚開始逐漸上調，魚雷形胚時期的轉錄水平約為愈傷組織時期的4倍，子葉胚時期達到最高，約為愈傷組織時期的6倍(圖3)。說明在龍眼體胚發生過程中，DlPPO1基因主要在后期即子葉胚時期表達。

2.4DlPPO1基因的組織特異性表達分析

為進一步探索DlPPO1基因的組織差異性表達特點，對其在龍眼不同組織部位(根、葉、花芽、成花、幼果、成熟果、果皮、果肉和種子)的相對表達量進行分析，結果表明，DlPPO1基因在葉片中表達量最高，在成花中也有少量存在，在龍眼其他組織部位表達量較低(圖4)。說明在龍眼生長發育過程中，DlPPO1基因主要在葉片和花中表達。

分支上的數字代表1 000次Bootstrap重復驗證中該節點的可信度百分比值圖2　DlPPO1系統進化樹Numbers at the nodes represent the bootstrap values based on 1 000 replicationsFig. 2　Phylogenetic tree for DlPPO1

圖1　DlPPO1蛋白保守結構域預測Fig. 1　Functional domains prediction for DlPPO1

2.5DlPPO1基因的激素應答及脅迫響應

植物PPO如何應對外界環境的變化及其反應機制的研究具有重要意義。低濃度MeJA誘導DlPPO1的表達，而高濃度MeJA抑制DlPPO1的表達，說明DlPPO1基因具有較復雜的茉莉酸響應機制；隨著SA處理濃度的提高，DlPPO1基因表達量整體呈現逐漸上升的趨勢，說明SA對DlPPO1具有正調控作用(圖5)。不同非生物脅迫的時序表達分析表明，NaCl模擬的鹽脅迫和甘露醇模擬的滲透脅迫處理下，隨著處理時間的延長DlPPO1基因總體表達量上升，而PEG模擬干旱脅迫也誘導DlPPO1表達，說明DlPPO1參與對鹽脅迫、滲透脅迫和干旱脅迫等多種非生物脅迫過程，其中對鹽脅迫的響應最為顯著。此外，ABA處理下DlPPO1基因的表達水平相對平穩，說明DlPPO1并不直接依賴于ABA激素信號途徑(圖6)。

EC.松散型胚性愈傷組織；ICpEC.不完全胚性緊實結構；GE.球形胚；HE.心形胚；TE.魚雷形胚；CE.子葉胚圖3　龍眼體胚發生過程中DlPPO1的相對表達量EC. embryogenic callus; ICpEC. incomplete compact pro-embryogenic cultures; GE. globular embryos; HE. heart-shaped embryos; TE. torpedo-shaped embryos; CE. cotyledon embryos.Fig. 3　Relative expression of DlPPO1 at different stages of longan SE

R.根；L.葉；FB.花芽；F.成花；YF.幼果；MF.成熟果；P.果肉；PC.果皮；S.種子圖4　龍眼不同組織部位DlPPO1的相對表達量R. Roots; L. Leaves; FB. Floral buds; F. Flowers; YF. Young fruits; MF. Mature fruits; P. Pulp; PC. Pericarp; S. Seeds.Fig. 4　Relative expression of DlPPO1 in different tissues of longan

3討論

3.1龍眼DlPPO1的潛在功能

生物膜將細胞分隔成帶有不同種類蛋白質的細胞器，并發揮各自不同的功能，蛋白質的亞細胞定位分析可以為研究其功能提供線索。由于PPO屬于核基因編碼的質體酶，基因在細胞質中表達后需經轉運至質體靶位點而發揮作用[22]，而本研究預測的DlPPO1具有較豐富跨膜結構的特點，正符合該基因的作用特征。質體醌是一種醌分子，與光合作用中的光反應的電子傳遞鏈有關。經本研究中預測DlPPO1可能定位于葉綠體基質中的類囊體上，推測DlPPO1有可能參與葉綠體中質體醌的形成，可能間接影響龍眼光合作用的電子傳遞鏈反應。

圖5　外源激素處理下DlPPO1 mRNA的相對表達量Fig. 5　Relative expression of DlPPO1 in response to exogenous phytohormones

圖6　非生物脅迫因素處理下DlPPO1 的相對表達量Fig. 6　Relative expression of DlPPO1 in response to abiotic stress

本研究中DlPPO1蛋白的結構特征符合前人關于PPO的報道。DlPPO1具有PPO蛋白的典型特征，含PPO1_DWL和PPO1_KFDV兩個結構域，同時還含有兩個保守的銅離子束縛區CuA和CuB雙結合位點[23]。另外DlPPO1 在龍眼中可能存在與ptcmiR1444s類似的翻譯抑制位點。

3.2DlPPO1的組織表達特性

植物PPO在不同組織中的表達具有特異性，如蘋果PPO在幼莖、幼葉、花瓣、枝皮等組織中均有表達，在幼葉中表達量最高而在花瓣中的表達量最低[24]；橄欖中幼嫩組織器官的PPO轉錄水平高于成熟組織[15]；荔枝PPO在花和葉中表達量最高，在果肉中表達量最低[16]。盡管果樹中有關于PPO在植物若干組織部位的差異性表達研究，但在種子形成之前的胚胎發育階段的表達調控研究尚未有報道，且龍眼PPO基因的表達調控研究仍為空白。龍眼胚性愈傷組織的轉錄組數據[25]中并沒有發現PPO基因的記錄，由此可初步推測，DlPPO1可能在龍眼胚胎發育早期表達量較低或者以其他前體等形式存在。通過對DlPPO1基因的在龍眼體胚發生過程的差異表達進行分析發現，DlPPO1從體胚發育中期開始積累，到子葉胚時期的相對表達量相對早期顯著上調，說明DlPPO1在龍眼體胚發育后期開始發揮關鍵作用，可能為參與幼胚發育及后期萌發等過程中的酚類氧化和木質素形成過程儲備營養物質和能量。DlPPO1在龍眼體胚發生過程中的表達調控機制仍需要今后進行進一步深入研究。組織特異性表達分析表明，DlPPO1在龍眼葉片中表達量最高，可能與其亞細胞定位于葉綠體基質有關；其次在花芽表達量較高，可能原因為相對較高的PPO活性有利于花芽分化[26]；而DlPPO1基因的在其他組織部位幾乎無表達，可見其表達具有組織特異性，且龍眼中可能還存在其他成員以實現PPO在龍眼不同組織部位的氧化還原反應調節。

3.3DlPPO1可能參與脅迫應答

激素在植物應對各種生物和非生物脅迫應答中發揮重要作用，已知茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)可作為植物抗病響應所需的信號分子來激活植物防御機制[27]；JA和SA分別與植物誘導性系統抗性 (ISR)和系統獲得性抗性 (SAR)有關[28]；植物體內ABA是應答生物脅迫和非生物脅迫的重要信號分子，許多逆境條件下其含量升高，從而提高植物自身抗逆性以應對外界環境[29]。有研究指出，植物激素信號產生的時間和豐度在決定植物病害程度中起著關鍵作用[30]。本研究中，DlPPO1的表達受到低濃度MeJA、SA、鹽脅迫、滲透脅迫和干旱脅迫的誘導，其中鹽脅迫的誘導作用最為顯著，而ABA對DlPPO1并沒有顯著的誘導作用，可見DlPPO1可能不直接依賴于ABA的逆境脅迫信號轉導途徑，而可能是通過JA或SA的逆境脅迫信號轉導途徑調控植物對脅迫的抗性。另外，楊樹miR1444可能通過作用于PPO基因參與毛果楊對外界環境脅迫的應答[6, 31]；本研究在楊樹miRNA數據庫中預測分析到DlPPO1也存在楊樹miR1444翻譯抑制位點，可見龍眼中可能也存在miR1444類似成員通過調控龍眼PPO的活動以應對外界環境變化。總之，究竟DlPPO1在龍眼體胚中如何調節植物細胞以應對脅迫，如何應答逆境信號轉導等一系列問題還需要進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1098-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1098

收稿日期:2016-03-05;修改稿收到日期:2016-04-26

基金項目:國家自然科學基金(31272149,31572088);福建省重大科技專項(2015NZ0002-1)

作者簡介:田奇琳(1990-)，女，博士，主要從事果樹生物技術研究。 *通信作者:賴鐘雄，博士，研究員，博士生導師，主要從事園藝植物生物技術與遺傳資源研究。E-mail：Laizx01@163.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

Cloning and Expression Analyses ofDlPPO1 fromDimocarpuslonganLour.

TIAN Qilin, LIN Yuling, ZHENG Qingyou, SU Rongfeng, LAI Zhongxiong*

(Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Abstract:Based on homology cloning techniques, we isolated the polyphenol oxidase gene (3 transcripts：DlPPO1-a，DlPPO1-b, and DlPPO1-c; Genbank：KM387405, KM516087, and KM516088) from leaves of longan (‘Sijimi’ cultivar) by RT-PCR and RACE．The full-length cDNA sequence of DlPPO1-a，DlPPO1-b, and DlPPO1-c were 1 969 bp, 1 960 bp and 1 920 bp, respectively, containing a 1 800 bp open reading frame (ORF) which encoded 599 amino acids; DlPPO1 shared high homology with PPO gene of Litchi chinensis, Canarium album, and Populus euphratica, etc. Bioinformatic analysis revealed that the deduced DlPPO1 protein with conserved domains shared the typical characteristics of the PPO family. QPCR analysis indicated that during somatic embryogenesis (SE) in longan, the expression level of DlPPO1 rose from the stage of heart embryo and then reached the highest at the stage of the cotyledon embryo, which suggested that DlPPO1 might play important roles during the middle and late stages of longan SE. It was detected that DlPPO1 abundantly accumulated in longan leaves, followed by flower buds; there was lower expression in other longan tissues. After exposure to phytohormones and abiotic stress, the expression of DlPPO1 was induced by salicylic acid (SA), methyl jasmonte (MeJA), NaCl, mannitol, and PEG treatments. Consequently, it suggested that DlPPO1 might participate in abiotic stress responsiveness.

Key words:longan; somatic embryogenesis; polyphenol oxidase; abiotic stress, real-time quantitative PCR