β-胡蘿卜素發酵及提取工藝的研究

梁穎超，金貞花，張廣昊，關 陽，韓文靜，王金枝，陶 進*

(1.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033)

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β-胡蘿卜素發酵及提取工藝的研究

梁穎超1，2，金貞花1，2，張廣昊1，2，關 陽1，2，韓文靜1，2，王金枝1，2，陶 進1，2*

(1.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033)

摘要[目的]研究三孢布拉氏霉菌β-胡蘿卜素發酵及其提取工藝的優化。 [方法]利用三孢布拉氏霉菌發酵β-胡蘿卜素，并通過分析發酵時間、干燥方法、保藏方式等因素對β-胡蘿卜素含量的影響，確定β-胡蘿卜素的制取工藝。[結果]試驗得出，最適發酵時間為5 d，干燥方法為真空冷凍干燥機干燥法，保藏方法為下罐后較短時間內提取。按此工藝條件得到的β-胡蘿卜素胞內含量為5.80%，發酵液中β-胡蘿卜素含量可達到0.44 g/L。[結果] 研究可為發酵法生產β-胡蘿卜素及其提取工藝研究提供參考依據。

關鍵詞三孢布拉氏霉菌；β-胡蘿卜素；發酵；提取

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，是一種橘黃色脂溶性化合物，是國際上公認的優秀天然色素，具有很強的抗氧化劑且為人體不可缺少的營養素[1]。β-胡蘿卜素因其著色功能，廣泛應用在食品和化妝品領域，加有β-胡蘿卜素的口紅、胭脂等化妝品色澤豐滿自然，食品中添加β-胡蘿卜素色澤金燦誘人。β-胡蘿卜素還具有較強的抗氧化性，其抗氧化性是維生素C的60倍、維生素E的10倍，可用于保護肌體免受氧自由基的毒害，具有抗癌、抗心血管病、抗白內障、抗老年性癡呆癥等保健功能[2]。β-胡蘿卜素還是維生素A的前體，可作為藥品和功能性添加劑，用于維生素A缺乏癥、光敏癥、皮膚粗糙等癥狀[3]。

隨著對β-胡蘿卜素需求量的增加[4]，越來越多的人研究其制取工藝[5-6]。常用的β-胡蘿卜素制取技術主要有化學合成法、提取法、生物合成法(發酵法)等。化學合成法是通過化學反應人工合成β-胡蘿卜素，產品為全反式結構；提取法則是從胡蘿卜、枸杞、玉米等天然植物中直接提取β-胡蘿卜素，生產效率低；而生物發酵法生產β-胡蘿卜素不受環境等條件的限制，產量高且屬于天然產品，天然β-胡蘿卜素產品的立體異構比合成的全反式結構在體內更容易被吸收、生物活性更強，因此在醫藥、食品及保健領域有著很好的應用前景。

利用三孢布拉氏霉菌發酵制得天然β-胡蘿卜素，因其成本較低、生產條件易實現、產量高等優點，被眾多企業實現了工業化生產[7]。三孢布拉氏霉菌發酵法得到的β-胡蘿卜素是胞內產物，因此要對發酵菌絲體進行收集，破碎菌體細胞以得到胞內產物。由于β-胡蘿卜素是脂溶性，不溶于水，因此水分的存在將會影響提取效果，在β-胡蘿卜素提取前要對菌絲體進行干燥，除去菌絲體中的水分，再用非極性有機溶劑進行提取。然而，天然β-胡蘿卜素在干燥過程中極易被氧化，降低了其生物活性，限制了其在醫藥、食品及保健品領域的應用。因此，β-胡蘿卜素干燥過程中找到一種低氧化率的干燥方式是非常重要的[8]。筆者以三孢布拉氏霉菌發酵法制得的發酵液為原料，采用干燥箱干燥法和真空冷凍干燥機干燥法，分別得到含天然β-胡蘿卜素的干菌體，最后利用紫外-分光光度計法進行β-胡蘿卜素含量檢測，確定最佳發酵時間、最適干燥方法和保藏方式對β-胡蘿卜素含量的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。β-胡蘿卜素發酵液，實驗室自制，三孢布拉氏霉菌發酵法制得。

1.1.2主要試劑。β-胡蘿卜素(標準品)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.3主要儀器與設備。全溫振蕩培養箱(HZQ-F160型)，哈爾濱東聯電子技術有限公司；電熱恒溫培養箱(303A-5型)，上海陽光實驗儀器有限公司；真空冷凍干燥機(MAXI-DRYLYO型)，法國Heto-holten；電熱恒溫鼓風干燥機(DHG-9070型)，上海精宏實驗設備有限公司；紫外分光光度計(8823B型)，北京賓達英創科技有限公司；電子天平(AL204型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2方法1.2.1菌絲體預處理。將三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)“+”、“-”菌株分別接種到PDA培養基上，在28 ℃溫度下培養72h。待菌株長出孢子后將菌落轉接三角瓶發酵培養基中，在28 ℃分別搖床培養72h得到發酵液，其中培養基組分包括：玉米粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂。將所得到的“+”菌發酵液取10%，接入“-”菌發酵液中，在28 ℃搖床培養4～6d。最終得到的發酵液采用濾網過濾，利用5L自來水洗滌，得到含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體。1.2.2β-胡蘿卜素標準曲線的繪制。精確稱取β-胡蘿卜素標準品50mg，用分析純的石油醚稀釋定容至50mL，吸取定容后的溶液1.0mL用石油醚繼續稀釋定容至100mL，此稀釋液含β-胡蘿卜素10μg/mL；分別吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL含β-胡蘿卜素10μg/mL的稀釋液，用石油醚定容至25mL，此時β-胡蘿卜素標準溶液濃度梯度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μg/mL；然后以石油醚為空白對照，采用分光光度計測定450nm波長處每個梯度標準溶液的吸光值；以標準品濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線1。

1.2.3β-胡蘿卜素含量的測定。收集發酵液中的菌體，經干燥箱或真空冷凍干燥后得到干菌體；用研磨法粉碎細胞，然后過 60～80目篩；準確稱取菌體粉末0.02g，菌體粉末放入燒杯，加入石油醚玻璃棒攪拌，萃取直至菌體粉末無色為止；用濾紙過濾萃取后的上清液，濾液倒入100mL容量瓶定容；取1mL溶液，用石油醚定容至25mL；根據β-胡蘿卜素的特征吸收波長在450nm條件下，用分光光度法測定吸光值，利用回歸方程計算出β-胡蘿卜素含量。樣品β-胡蘿卜素含量的計算公式如下：

樣品β-胡蘿卜素含量(mg/g干菌體)=(C×D×V)/(1 000×m)

式中，C為由標準曲線查得或由回歸方程算出的樣品的溶液濃度(μg/mL)；D為色素萃取液的稀釋倍數(25倍)；m為萃取所用的干菌體樣品質量(0.02g)；V為萃取所用的石油醚體積(100mL)；1 000為將β-胡蘿卜素含量單位由μg/g換算成mg/g。

β-胡蘿卜素的含量(mg/L發酵液)=菌體干重(g/L)×樣品β-胡蘿卜素含量(mg/g干菌體)

1.3干菌體制備方法

1.3.1烘箱干燥法制備。菌絲體預處理過程，同“1.2.1”。將洗滌好的含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體放入40 ℃烘箱烘干4h，直至菌絲體恒重，將干燥好的菌絲體取出，用研缽研磨粉碎細胞，然后過60目篩，得到烘箱干燥法干燥含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

1.3.2真空冷凍干燥機法制備。菌絲體預處理過程，同“1.2.1”。將洗滌好的含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌菌絲體預凍，再利用真空冷凍干燥機干燥4h，直至菌絲體恒重，將干燥好的菌絲體取出，用研缽研磨粉碎細胞，然后過60目篩，得到真空冷凍干燥機法干燥含β-胡蘿卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

2結果與分析

2.1β-胡蘿卜素標準曲線通過檢測不同濃度的β-胡蘿卜素標準品吸光度，繪制了其標準曲線，如圖1。β-胡蘿卜素標準曲線回歸方程為：y=0.118 7x-0.001 7，R2=0.997 5，線性區間為0～1.6μg/mL，其中x(μg/ml)為標準品濃度，y為波長450nm處吸光度。

圖1　β-胡蘿卜素標準曲線Fig.1　The standard curve of β-carotene

2.2發酵時間對β-胡蘿卜素得率的影響微生物的生長經歷調整期、生長期、穩定期和衰亡期，因此發酵時間對菌體生長和代謝產物的產量影響比較大，為了積累更多的β-胡蘿卜素，需要確定最佳發酵時間。圖2表示菌體干重和菌體中的β-胡蘿卜素含量隨時間的變化，從圖2可以看出，兩者均在發酵第5天時最高，其值分別為6.7g/L和58.127mg/g(凍干機干燥法檢測結果)。這說明發酵第5天時，三孢布拉氏霉菌的生長處于穩定期，菌體數量積累最多；同時，細胞內合成β-胡蘿卜素的酶系已完全形成，因此積累了大量的β-胡蘿卜素。從圖3可以看出，發酵液中β-胡蘿卜素含量的最高值也出現在發酵第5天，即0.44g/L。唐玲在文獻中報道，三孢布拉氏霉菌在第5天進入細胞生長穩定期[9]，這與該試驗中得到的結論一致。因此選擇5d為最適發酵周期，后續試驗均采用發酵5d的發酵液。

圖2　發酵時間對菌體中β-胡蘿卜素含量和菌體干重的影響 Fig.2　Effects of fermentation time on thalli β-carotene content and thalli dry weight

圖3　發酵時間對發酵液中β-胡蘿卜素含量的影響Fig.3　Effects of fermentation time on β-carotene content in fermentation liquid

2.3不同干燥法對β-胡蘿卜素含量的影響天然β-胡蘿卜素在干燥過程中很容易被氧化，降低其生物活性，因此，在β-胡蘿卜素干燥過程中找到一種低氧化率的干燥方式非常重要。常用的菌體干燥法有：干燥箱干燥法和真空冷凍干燥機干燥法，前者應用最廣泛，操作方便、設備簡單；后者因其干燥過程不經過水分的液態轉化而直接升華，能保持物料的物理性質和化學組成，但生產成本較高。該試驗以三孢布拉氏霉菌菌絲為原料，采用此2種干燥法分別制得干菌體，比較了這2種干燥法對β-胡蘿卜素含量的影響，結果見圖4。

圖4　不同干燥方式對菌體中β-胡蘿卜素含量的影響Fig.4　Effects of different drying methods on β-carotene content in thalli

從圖4可以看出，使用真空冷凍干燥機干燥制得的干菌體中的β-胡蘿卜素含量明顯高于烘箱干燥制得的干菌體中的β-胡蘿卜素含量。圖5是β-胡蘿卜素的分子結構式，可以看出β-胡蘿卜素分子具有多雙鍵結構，對光、熱、氧等因素都很敏感，很容易氧化分解和異構化[10-11]。因此，β-胡蘿卜素在低溫真空條件下穩定性更好，在較高溫度(40 ℃)和空氣接觸環境中更容易被氧化。考慮到β-胡蘿卜素是一種高附加值的產品，降低β-胡蘿卜素的氧化降解率對收益率的提高影響較大，在菌體干燥工藝中應選擇真空冷凍干燥法干燥菌體。

圖5　β-胡蘿卜素的分子結構式Fig.5　Molecular structure of β-carotene

2.4保藏方式對β-胡蘿卜素降解的影響由于β-胡蘿卜素分子中含有很多共軛雙鍵，化學性質不穩定，很容易被氧化降解，保藏方式對β-胡蘿卜素的降解有很大的影響。首先，圖6中比較了未經保藏的β-胡蘿卜素和經過20h避光10 ℃保藏(分別稀釋2 500倍低濃度保藏和稀釋100倍高濃度保藏)的β-胡蘿卜素干粉中β-胡蘿卜素含量。從圖6可以看出，菌體中β-胡蘿卜素和發酵液中的β-胡蘿卜素經過20h的保藏，其含量均有明顯下降。從圖6中還可以看出，低濃度(石油醚稀釋2 500倍)保藏的β-胡蘿卜素溶液中的β-胡蘿卜素殘留比高濃度(石油醚稀釋100倍)保藏的更多。這是因為低濃度時溶液中β-胡蘿卜素物質的量少，底物與氧氣接觸的概率要小很多，導致β-胡蘿卜素降解率下降。

圖6　不同保藏方式對β-胡蘿卜素降解的影響Fig.6　Effects of different storage methods on β- carotene degradation

因此，β-胡蘿卜素發酵液的干燥和干粉的提純工藝都應在下罐之后較短的時間內完成，這樣才能降低β-胡蘿卜素的氧化降解。在β-胡蘿卜素后處理過程中如需保藏，應在低濃度條件下保藏，從而降低其損失。

3結論

綜上所述，利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素5d為最適發酵周期；在菌體干燥工藝中選擇真空冷凍干燥法干燥菌體；β-胡蘿卜素發酵液的干燥和干粉的提純工藝都應在下罐之后較短的時間內完成為宜；低濃度保藏方式有利于降低β-胡蘿卜素的降解率。在此條件下制得的β-胡蘿卜素胞內含量為5.80%，發酵液中β-胡蘿卜素含量可達到0.44g/L。

該研究中得出最佳發酵時間、最適干燥法和最適保藏方式，最大限度地降低了制取過程中β-胡蘿卜素的氧化降解損失，可為利用三孢布拉氏霉菌發酵法制取β-胡蘿卜素工藝提供參考依據。

參考文獻

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基金項目吉林省科技計劃項目(20130305024NY)。

作者簡介梁穎超(1988- )，女，黑龍江肇源人，助理工程師，碩士，從事玉米深加工研究。*通訊作者，博士，從事生物催化與生物化工研究。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號Q 503

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-070-03

FermentationandExtractionProcessofβ-carotene

LIANGYing-chao1,2,JINZhen-hua1,2,ZHANGGuang-hao1,2,TAOJin1,2*

(1.TheNationalEngineeringResearchCenterofCornDeepProcessing,Changchun,Jilin130033; 2.COFCO(Jilin)Bio-ChemicalCo.,Ltd.,Changchun,Jilin130033)

Abstract[Objective] To optimize the fermentation and extraction technology of β-carotene in Blakeslea trispora. [Method] β-carotene was fermented by Blakeslea trispora. Effects of fermentation time, drying method and storage method on β-carotene content were researched. The processing technology of β-carotene was determined. [Result] The optimal fermentation time was 5 d; the drying method was vacuum freeze drying; and the storage method was extracting as soon as possible after the fermentation. Under this condition, β-carotene contents in thalli and fermentation liquid were 5.80%; and 0.44 g/L, respectively. [Conclusion] This research provides references for the research and extraction of β-carotene by fermentation method.

Key wordsBlakeslea trispora; β-carotene; Fermentation; Extraction