徐州北郊魚(yú)塘水體細(xì)菌多樣性研究及致病菌分析

徐秀麗，殷婷婷，溫洪宇，孫怡，高霞莉

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇　徐州　221116）

徐州北郊魚(yú)塘水體細(xì)菌多樣性研究及致病菌分析

徐秀麗，殷婷婷，溫洪宇，孫怡，高霞莉

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州221116）

魚(yú)塘的健康養(yǎng)殖受到多種因素的制約，如魚(yú)的種類以及魚(yú)塘的面積大小等，同時(shí)，魚(yú)塘水體中的細(xì)菌對(duì)魚(yú)類存活更是帶來(lái)重大影響。本文對(duì)徐州北郊鯽魚(yú)魚(yú)塘水體中細(xì)菌多樣性及致病菌對(duì)鯽魚(yú)存活狀況的影響進(jìn)行了研究，為補(bǔ)充完善我國(guó)魚(yú)塘養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的物種資源及魚(yú)塘健康養(yǎng)殖提供了重要參考依據(jù)，旨在進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)魚(yú)塘的科學(xué)管理。水樣采集于夏季6月份，為魚(yú)病頻發(fā)季節(jié)，氣溫與水溫相對(duì)較高，魚(yú)塘中細(xì)菌數(shù)量多。研究主要是通過(guò)對(duì)鯽魚(yú)魚(yú)塘水體中細(xì)菌的總DNA進(jìn)行提取，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增并依據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行分子發(fā)育學(xué)研究，最后獲得水體中細(xì)菌物種的組成。它們分別為崛越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii）、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）、印度芽孢桿菌（Bacillus indicus）、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai。經(jīng)檢測(cè)其中Aeromonas punctata、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）及溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）為致病菌。

多樣性；陽(yáng)性菌；陰性菌；致病菌；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們生活質(zhì)量逐漸提高，水產(chǎn)品的日需量呈上升趨勢(shì)，使得我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有很大的發(fā)展［1］。魚(yú)塘養(yǎng)殖是我國(guó)飼養(yǎng)食用魚(yú)的重要手段之一，在養(yǎng)殖過(guò)程中，魚(yú)塘水體中的細(xì)菌對(duì)魚(yú)類的生存帶來(lái)了很大的影響。在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，細(xì)菌占據(jù)重要地位，對(duì)魚(yú)塘環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)有很大影響，它不僅作為分解者，也是魚(yú)類重要的生存指標(biāo)［2］，且細(xì)菌在促進(jìn)水體有機(jī)物分解、營(yíng)養(yǎng)鹽釋放和保持良好的水質(zhì)方面也發(fā)揮了極大的作用［3］。

近年來(lái)，很多國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)魚(yú)塘中的細(xì)菌做出分析與研究，包括細(xì)菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)、對(duì)魚(yú)類生存的影響、特殊菌株細(xì)胞生活機(jī)制等。如Ahmed H.Al-Harbi等研究沙特阿拉伯某魚(yú)塘水體底泥中細(xì)菌群落隨季節(jié)變化的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)魚(yú)塘水體底泥中的細(xì)菌數(shù)量各不相同，其中夏季魚(yú)塘水體底泥中細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到了高峰［4-5］；程瑩寅等對(duì)養(yǎng)殖草魚(yú)魚(yú)塘水體中細(xì)菌的多樣性特征進(jìn)行了研究，表明魚(yú)塘水體底泥中細(xì)菌含量十分豐富且存在致病菌種，給魚(yú)塘中草魚(yú)的生存帶來(lái)威脅［6］；邵桂元等對(duì)影響魚(yú)類健康的細(xì)菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)蛭弧菌可減少魚(yú)塘中魚(yú)類疾病的發(fā)生，降低魚(yú)類病死率［7］；楊艷等人研究了巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)塘水質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)魚(yú)塘水質(zhì)凈化具有明顯作用［8］。充分研究徐州北郊鯽魚(yú)魚(yú)塘水體中細(xì)菌的數(shù)量變化及致病菌對(duì)生存的影響將有助于我們了解魚(yú)塘生態(tài)系統(tǒng)中的這一重要資源，給魚(yú)類養(yǎng)殖模式的優(yōu)化及有效控制病害發(fā)展帶來(lái)重大的意義［9］。

16S rRNA基因序列檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)應(yīng)用廣泛，如曹波等人曾利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)江口細(xì)菌得到細(xì)菌群落組成［10］；朱詩(shī)應(yīng)等的研究表明16S rDNA測(cè)序技術(shù)能夠區(qū)分細(xì)菌并將其鑒定到具體種水平［11］。16S rRNA基因是核糖體RNA的一個(gè)小亞基，由16S rDNA編碼而來(lái)［12］。本研究基于16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分子發(fā)育學(xué)分析的方法檢測(cè)出水體中9種不同的細(xì)菌，分析該魚(yú)塘中細(xì)菌的多樣性及致病菌的功能作用，為魚(yú)塘健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)魚(yú)塘的合理放養(yǎng)，科學(xué)管理。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1水樣采集試驗(yàn)所選用的水體樣品于2014 年6月采集于徐州北郊鯽魚(yú)養(yǎng)殖魚(yú)塘。用采水器采樣，4℃保存。

1.1.2配制培養(yǎng)基試驗(yàn)前配制好培養(yǎng)基，放置在壓力蒸汽滅菌器中，溫度設(shè)置為121℃滅菌25 min，備用。

1.1.3主要儀器PCR擴(kuò)增儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LX-100手掌型離心機(jī)、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DNA回收試劑盒、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1對(duì)菌種進(jìn)行劃線分離與純化并斜面保存采取水樣后，4℃保存。試驗(yàn)時(shí)取1 mL水樣接種到滅菌后的固體培養(yǎng)基上，放置在37℃環(huán)境下培養(yǎng)3 d。對(duì)平板上的單一菌落反復(fù)劃線以達(dá)到分離目的，最終得到純菌株，接種至斜面，4℃保存。

1.2.2革蘭染色若在顯微鏡下觀察到染色結(jié)果是紫色，則可以判斷為革蘭陽(yáng)性菌；若是紅色，則判斷為革蘭陰性菌。

1.2.3細(xì)菌總DNA抽提及電泳分析抽提細(xì)菌的總DNA基因組于-20℃保存?zhèn)溆茫粚?duì)總DNA進(jìn)行電泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色最后采用BIORAD系統(tǒng)拍照。

1.2.4細(xì)菌的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增時(shí)設(shè)置以27F和1492R分別作為正向引物和反向引物。正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（對(duì)應(yīng)于E. coli 16S rRNA基因的8-27個(gè)堿基位置）。反向引物1492R：5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3'（對(duì)應(yīng)于E.coli 16S rRNA基因的第1492—1510個(gè)堿基位置）［13］。在95℃條件下進(jìn)行預(yù)變性；約5 min后變性，溫度為94℃，45 s后，降溫至55℃退火45s，72℃延伸1 min，此過(guò)程重復(fù)多次后得到的產(chǎn)物在低溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析在冷卻的1%的瓊脂糖凝膠中加入3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，放入到電泳槽中，在電壓92V，電泳時(shí)間40 min條件下進(jìn)行電泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色，最后采用BIO-RAD系統(tǒng)拍照。

1.2.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收空且干凈的離心管稱重；加入從凝膠上剪切下的單一目的基因條帶，再稱重；接著向0.1 g凝膠中加入3倍體積的溶膠液即300 μL，水浴溫度為55℃，時(shí)間為10 min；將剛獲得的溶液倒進(jìn)吸附柱，放至管內(nèi)離心，棄去上層液體，放至原管內(nèi)。在吸附柱中兩次分別加入700 μL、500 μL漂洗液，重復(fù)上述步驟最后洗去漂洗液；吸附柱暴露放置除掉未洗凈的溶液；最后把吸附柱放在管內(nèi)，加洗脫液，25℃靜放3 min，離心60 s；低溫保藏目的基因。

1.2.7測(cè)序測(cè)出菌種的目的基因產(chǎn)物序列。

1.2.8構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并進(jìn)行分子發(fā)育學(xué)分析研究。

2　結(jié)果與分析

2.1革蘭染色結(jié)果

劃線分離之后獲得純種菌株，分別編號(hào)A2、A3、A4、A5、A6、B2、B3、B4、C1，其中 A2、A4、A5、B2、B3、C1染色結(jié)果為紫色，因而可以判斷為革蘭陽(yáng)性菌；A3、A6、B4染色結(jié)果為紅色，因而可以判斷為革蘭陰性菌。

2.2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖1可以看出：革蘭陽(yáng)性菌A2與芽孢桿菌屬中的模式菌株崛越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii DSM 8719T） 聚為一支，登錄號(hào)為X76443，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為A2與Bacillus horikoshii屬于同一物種［14］；革蘭陽(yáng)性菌A4與芽孢桿菌屬中的模式菌株（Bacillus thaonhiensis NHI-38 T）的16S rRNA基因序列同源性高于98%，其登錄號(hào)為JQ796719，置信度為100%，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系相近且屬于同一物種；革蘭陽(yáng)性菌A5與葡萄球菌屬中的 模式菌 株溶血 葡萄球 菌（Staphylococcushaemolyticus ATCC 29970 T）聚為一支，登錄號(hào)為L(zhǎng)37600，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為 A5與 Staphylococcus haemolyticus為同一物種；革蘭陽(yáng)性菌B2與芽孢桿菌屬中的模式菌株印度芽孢桿菌（Bacillus indicus Sd/3T）聚為一支，登錄號(hào)為AJ583158，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為B2與Bacillus indicus屬于同一物種；革蘭陽(yáng)性菌B3與模式菌株（Fictibacillus phosphorivorans Ca7T T）的16S rRNA基因序列同源性達(dá)到了98%以上，其登錄號(hào)為JX258924，置信度為100%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為B3與Fictibacillus phosphorivorans為同一物種，屬于芽孢桿菌屬；革蘭陽(yáng)性菌C1與芽孢桿菌屬中的模式菌株（Bacillus aryabhattai B8W22T）聚為一支，登錄號(hào)為HQ433471，置信度為100%且同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為C1與Bacillus aryabhattai屬于同一物種。

圖1　鄰接法構(gòu)建的16S rRNA基因序列的革蘭陽(yáng)性菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2　鄰接法構(gòu)建的16S rRNA基因序列的革蘭陰性菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖2可以看出：革蘭陰性菌A3與氣單胞菌屬中的模式菌株（Aeromonas punctata subsp.caviae ATCC 15468 T）的16S rRNA基因序列同源性達(dá)到了98%以上，其登錄號(hào)為X74674，置信度為99%，親緣關(guān)系相近，所以A3與Aeromonas punctata subsp.caviae屬于同一物種；革蘭陰性菌A6與模式菌株（Shigella flexneri ATCC 29903T）聚為一支，登錄號(hào)為X96963，置信度為98%且同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認(rèn)為A6與Shigella flexneri屬于同一物種，中文名稱為弗氏志賀菌，屬于志賀菌屬；革蘭陰性菌B4與腸桿菌屬中的模式菌株（Enterobactersoli LF7aT）的16S rRNA基因序列同源性達(dá)到了98%以上，其登錄號(hào)為CP003026，置信度為99%，所以兩者親緣關(guān)系相近，屬于同一物種。

3　討論

魚(yú)塘中細(xì)菌數(shù)量隨著季節(jié)交替呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，選擇6月份采集水樣是由于水體中細(xì)菌數(shù)量較多，且致病菌十分活躍，夏季光照較強(qiáng)，氣溫與水溫相對(duì)較高，水中藻類數(shù)量增多，水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，導(dǎo)致水體中細(xì)菌數(shù)量大幅度增多；春季和秋季水體中細(xì)菌數(shù)量保持在一定的范圍之內(nèi)，冬季氣溫較低，水體中的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少［15］。

本文所獲得的9種菌株，其中A2、A4、B2、B3、C1均屬于芽孢桿菌屬，A3屬于氣單胞菌屬，A5屬于葡萄球菌屬，A6屬于志賀菌屬，B4屬于腸桿菌屬。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)水體中存在大量的致病菌，如本試驗(yàn)中的氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。

文章研究的3種致病菌對(duì)魚(yú)類均可產(chǎn)生一定的致病性。氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）致病性很強(qiáng)，在淡水、海水、魚(yú)類及脊椎動(dòng)物腸道最為常見(jiàn)，能引起鯽魚(yú)、鯉魚(yú)等魚(yú)類和家禽以及人體共同患病，故魚(yú)塘管理人員應(yīng)采取措施抑制該致病菌對(duì)魚(yú)類的危害，從而提高該魚(yú)塘中鯽魚(yú)產(chǎn)量與質(zhì)量［16］。蘇國(guó)富研究表明弗市志賀菌（Shigella flexneri）是典型的致病菌，它的有毒基因分布在魚(yú)類染色體和大質(zhì)粒上，對(duì)魚(yú)塘中如鯽魚(yú)、羅非魚(yú)等魚(yú)類生長(zhǎng)有一定的危害，表現(xiàn)為呼吸困難，體內(nèi)供能物質(zhì)合成受阻，最終耗盡營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致重大疾病甚至死亡［17］。溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）會(huì)使魚(yú)類皮膚受損甚至壞死，一旦作用于魚(yú)體細(xì)胞時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使魚(yú)類死亡。

氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）這三種致病菌會(huì)破壞魚(yú)塘中原有的生態(tài)平衡，使魚(yú)類的自身機(jī)能受限、發(fā)育遲緩、免疫機(jī)制受阻，患病概率增加并且病死率上升，導(dǎo)致魚(yú)塘中魚(yú)類的生存受到極大的威脅［18］。在夏季魚(yú)類疾病高發(fā)時(shí)段，為提高產(chǎn)量，健康養(yǎng)殖，管理人員應(yīng)提前做好對(duì)致病菌的防范措施，向魚(yú)塘中投放能抑制氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）生長(zhǎng)的抑制劑或投放如益生菌等促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)改善水體環(huán)境的菌液并定期給魚(yú)塘換水。另外，投放益生菌菌液不宜過(guò)多，在一定的范圍內(nèi)，投放菌液濃度越高效果越好，超過(guò)了某一特定范圍效果則會(huì)降低［19］。

在魚(yú)塘水體中發(fā)現(xiàn)的9種菌里有5種均屬于芽孢桿菌，而芽孢桿菌對(duì)于魚(yú)塘水體的影響已有許多研究，如楊鶯鶯等［20］研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)塘水體細(xì)菌群落特征受芽孢桿菌的影響，其通過(guò)改善代謝能力進(jìn)而使細(xì)菌對(duì)有機(jī)廢物的分解能力大幅提升，達(dá)到改善水質(zhì)的目的；董愛(ài)華等［21］發(fā)現(xiàn)在羅非魚(yú)魚(yú)塘中添加芽孢桿菌，水體透明度明顯增加，魚(yú)塘中NH3、NH4+、H2S等含量明顯下降，同時(shí)有害藻繁殖速度明顯降低，該研究表明芽孢桿菌屬能改良水體水質(zhì)，預(yù)防魚(yú)類疾病。可見(jiàn)徐州北郊鯽魚(yú)魚(yú)塘水體中的A2 （Bacillus horikoshii）、A4（Bacillus thaonhiensis）、B2 （Bacillus indicus）、B3（Fictibacillus phosphorivorans）、C1（Bacillus aryabhattai）等芽孢桿菌對(duì)于改善魚(yú)塘水質(zhì)，降低魚(yú)類發(fā)病率有著重要作用，因此在魚(yú)塘養(yǎng)殖過(guò)程中管理人員還可以通過(guò)適量投放芽孢桿菌作為益生菌的方法，更大程度上凈化魚(yú)塘水質(zhì)，提高魚(yú)類產(chǎn)量。

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Study on bacterial diversity and analysis of pathogenic bacteria in fish pond water in the north of Xuzhou

Xu Xiuli，Yin Tingting，Wen Hongyu，Sun Yi，Gao Xiali
（School of Life Science Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China）

Healthy breeding of fish ponds restricted by many factors，such as the types of fish and fish ponds area size，etc.，at the same time，the bacteria in fish pond water for fish survival but also bring significant impact. Study on the effect of bacterial diversity and pathogen on fish survival status of the fish pond water in the north of Xuzhou can not only improve our microbial species resources of aquiculture environment，but also provide an important reference for the healthy breeding of the fish ponds.Water samples were collected in the summer of June，the temperature and the temperature is relatively high.The research is mainly through 16S rRNA gene sequencing of the fish pond water bacteria in the north of Xuzhou，and the 16S rRNA gene sequence analysis of phylogenetic tree construction，finally get the composition of bacterial species in water.After testing，we found that there were nine kinds of bacteria in fish pond water，they were Bacillus horikoshii、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、Staphylococcus haemolyticus、Shigella flexneri、Bacillus indicus、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai.The Aeromonas punctata、Staphylococcus haemolyticus and Shigella flexneri were pathogenic bacteria.

diversity；Gram-negative bacteria；Gram-positive bacteria；pathogenic bacteria；16S rRNA；Phylogenetic tree

S949

A

1004-2091（2016）01-0019-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2016.01.004

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410320026）

徐秀麗（1993-），女，理學(xué)學(xué)士，研究方向：微生物學(xué).E-mail：821311076@qq.com

溫洪宇（1973-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.E-mail:wenhy2007@126.com

2015-06-17）