芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經糖基化終末產物、聚ADP核糖聚合酶基因表達的影響

崔李群 方朝暉 羅 云

芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經糖基化終末產物、聚ADP核糖聚合酶基因表達的影響

崔李群1方朝暉2羅 云1

目的探討芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病周圍神經病變（DPN）的作用機制。方法SD大鼠65只，隨機留取10只為空白對照組，其余55只給予高脂飼料喂養4周后，空腹12h鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg一次性腹腔注射復制DPN大鼠模型，將42只成模大鼠分為模型組（M組）9只、芪歸糖痛寧顆粒高劑量組（QTG高組）、芪歸糖痛寧顆粒低劑量組（QTG低組）和甲鈷胺片組（J組）組各11只，分別予以相應藥物灌胃，空白對照組（Con組）和模型組實驗期間予以生理鹽水灌胃，療程12周，實驗結束后，分別對大鼠空腹血糖（FPG）、神經傳導速度、血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、神經生長因子（NGF）水平及坐骨神經糖基化終末產物（AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（PARP）基因的表達進行檢測。結果治療后，與模型組（M組）比較，芪歸糖痛寧顆粒高（QTG高組）、低劑量（QTG低組）組均能降低糖尿病大鼠血糖[（14.08±3.54）mmol/L、（16.11±2.95）mmol/L比（20.41±2.25）mmol/L，P＜0.01或P＜0.05）]，改善神經傳導速度（49.16±5.37）m/s、（43.76± 3.93）m/s比（39.66±3.65）m/s，P＜0.01或P＜0.05）]，降低血清MDA水平（14.91±1.23）nmol/L、（15.22± 0.55）nmol/L比（16.75±1.67）nmol/L，P均＜0.05）]，降低坐骨神經AGEs mRNA的表達（0.572± 0.021，0.983±0.013比1.088±0.032，P均＜0.01），降低PARP mRNA的表達（0.677±0.035、0.829± 0.015比1.113±0.024，P＜0.01）；與模型組（M組）比較，芪歸糖痛寧顆粒高劑量組升高血清SOD水平（112.87±4.98）U/mL比（97.55±4.93）U/mL，P＜0.01），升高血清NGF水平[（37.38±4.51）ng/L比（26.06±4.41）ng/L，P＜0.01）]。結論芪歸糖痛寧顆粒通過抑制氧化應激與AGEs、PARP途徑的相互作用，從而防治和延緩大鼠糖尿病周圍神經病變的發生。

大鼠；糖尿病周圍神經病變；芪歸糖痛寧顆粒；AGEs；PARP

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者常見且致殘性較高的慢性并發癥之一。由于缺乏統一的診斷標準和檢測方法，其患病率有較大差異，在10%～96%[1]。芪歸糖痛寧顆粒是在臨床經驗的基礎上開發的中藥復合制劑，初步研究表明其對治療DPN安全有效[2]。本研究以鏈脲佐菌素誘發實驗性DPN大鼠模型，以神經營養藥甲鈷胺作為對照，觀察芪歸糖痛寧顆粒對氧化應激及糖基化終末產物（advanced glycationend products，AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP）基因表達的影響，為其臨床治療DPN提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SD雄性大鼠65只，清潔級，體質量180～220g，安徽省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（皖）2011-002。

1.2 藥品與試劑芪歸糖痛寧顆粒（安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，批號20110809）；甲鈷胺片[衛材（中國）藥業有限公司，批號1309007]；鹽酸二甲雙胍片（上海施貴寶制藥有限公司，批號1208091）；大鼠血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、AGEs、PARP試劑盒（南京建成科技有限公司）。

1.3 儀器血糖儀、試紙（美國強生公司）；普通PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司）；UV-754紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠）；紫外凝膠成像分析儀（北京科創銳新生物科技有限公司）；溫度梯度基因擴增儀（德國MIONETRA）；ELX808及EKX-50酶標儀、洗板機（美國BIO-TEK，EKX-50）；計算機MS2000多媒體化生物信號記錄分析系統。

2 實驗方法

2.1 模型建立及分組65只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為空白對照組10只和造模組55只。空白對照組喂養方式不變，其余大鼠進行4周的高脂飼料喂養后，禁食12h予鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg一次性腹腔注射，誘發DPN大鼠模型[3]。空白對照組注入等容量檸檬酸緩沖液。于72h后測尾靜脈采血隨機血糖，以血糖≥16.7mmol/L列入觀察對象。42只成模大鼠隨機分為模型組（M組）9只、芪歸糖痛寧顆粒高劑量組（QTG高組）、芪歸糖痛寧顆粒低劑量組（QTG低組）、甲鈷胺片組（J組）各11只。實驗期間空白對照組（Con組）喂以基礎飼料至實驗結束，余四組均喂以高脂飼料。

2.2 給藥方法給藥劑量參考《藥理實驗方法學》[4]，大鼠等效劑量相當于人的6.3倍。根據每只大鼠體質量不同，計算大鼠每日給予芪歸糖痛寧顆粒灌胃劑量，其中QTG高組為等效劑量的2倍[12g/（kg·d）]，QTG低組為等效劑量的0.5倍[3g/（kg·d）]。甲鈷胺片劑量參照文獻[5]按照0.3（mg/kg·d）給藥，根據大鼠體質量計算每天灌胃量。以上各組，實驗全程均以鹽酸二甲雙胍，使用劑量為臨床成人劑量10倍，用其混懸液灌胃，作為基礎降糖治療。Con組與M組實驗期間予以生理鹽水5mL/（kg·d）灌胃。以上藥物混懸液均以蒸餾水配制，每2周稱體質量調藥量。各組均每日灌胃1次，連續12周。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 大鼠坐骨神經傳導速度測定用藥12周末，大鼠予以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射進行麻醉，在左坐骨切跡插入電極，在踝部（遠端）和左足底第二趾間分別插入記錄電極并連接計算機MS2000多媒體化生物信號記錄分析系統，記錄遠近端坐骨神經產生動作電位的潛伏期，測定兩記錄電極間的距離，并計算MNCV（m/s）。MNCV=電極之間的距離/動作電位潛伏期，比較各組大鼠神經傳導速度的變化。

2.3.2 大鼠血清SOD、MDA、NGF水平測定采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD水平，硫代巴比妥酸法檢測血清MDA水平，雙抗體夾心ELISA法測定大鼠血清NGF水平。試劑盒購自南京建成科技有限公司，具體方法嚴格按說明書進行。

2.3.3 大鼠坐骨神經AGEs、PARP mRNA表達的檢測取大鼠坐骨神經，提取總RNA后進行逆轉錄反應，qPCR擴增，以GAPDH作為內參照。AGEs引物上游：5'-CAACCCAGACTCGAGGAGAG-3'，下游：5'-AGAAAGTGGCTCGAGGTTGA-3'，產物片段223bp；PARP引物上游：5'-CTGGAGTCCGACAAGGAGAG-3'，下游：5'-TCACCGCCAGCTTCTTTACT-3'，產物片段250 bp；GAPDH引物上游：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，產物片段496bp。采用自動電泳凝膠成像分析儀分析。

2.4 統計學方法應用SPSS17.0軟件包，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s） 表示，非正態分布的數據可通過對數變換等使其接近正態分布；多個均數間比較采用方差分析，兩樣本比較采用t檢驗；計數資料用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

實驗造模時，DM大鼠造模有13只未達到高血糖標準予以剔除；實驗過程中，因大鼠血糖過高、灌胃過程中操作不當、大鼠自身打斗等原因，J組死亡2只，Con組死亡1只；M組死亡1只；QTG高組死亡1只，QTG低組死亡1只。至實驗結束時，各組剩余大鼠數分別為Con組9只：M組8只、J組9只、QTG高組10只、QTG低組10只。

3.1 各組大鼠空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）比較治療前M組、QTG高、低組和J組大鼠FPG均高于Con組（P＜0.01）。治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠FPG均高于Con組（P＜0.01）。QTG高、低組和J組大鼠均低于M組（P＜0.01或P＜0.05），但此三組之間FPG比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖（FPG）比較（mmol/L，x±s）

3.2 各組大鼠坐骨神經傳導速度比較治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠坐骨神經傳導速度均低于Con組（P＜0.01）；QTG低組和J組大鼠均高于M組（P＜0.05），QTG高組與M組比較，升高明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經傳導速度比較（m/s，x±s）

3.3 各組大鼠血清SOD、MDA、NGF比較治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠血清SOD水平均低于Con組（P＜0.01）；與M組比較，QTG高組和J組大鼠血清SOD水平均有升高（P＜0.01或P＜0.05）；QTG高組與J組比較有所升高（P＜0.05）；QTG高組與QTG低組比較有所上升（P＜0.01）。J組與QTG低組比較有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠血清MDA水平均高于Con組（P＜0.01）；QTG高、低組和J組大鼠血清MDA水平與M組比較均有下降（P＜0.05），但此三組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。M組、QTG低組和J組大鼠血清NGF水平均低于Con組（P＜0.01），QTG高組雖低于Con組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；QTG高組和J組大鼠血清NGF水平與M組比較均有升高（P＜0.01或P＜0.05）。QTG低組大鼠血清NGF水平與M組比較雖有升高，但無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、神經生長因子（NGF）比較（x±s）

3.4 各組大鼠坐骨神經AGEs、PARP mRNA表達比較QTG高、低組和J組大鼠AGEs、PARP mRNA表達均高于Con組，低于M組（P＜0.01）；大鼠AGEs mR-NA表達，QTG高組低于J組（P＜0.05），QTG低組高于J組（P＜0.01）。大鼠PARP mRNA表達，QTG高、低組均低于J組（P＜0.01）。見表4，圖1（插頁）。

表4 各組大鼠坐骨神經糖基化終末產物（AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（PARP）基因表達比較（x±s）

4 討論

DPN發病機制尚未完全明確。目前認為氧化應激效應和氧自由基直接損傷在DPN發病過程中起著重要作用。MDA是細胞內脂質過氧化反應的最終產物，其含量能夠體現組織細胞中氧自由基的含量；SOD通過一系列化學反應緩沖及清除自由基而顯示出抗氧化損傷的作用，是機體內抗氧化系統的重要組成部分。氧化應激與糖基化終末產物AGEs形成途徑在DPN發病中相互促進、相互影響。AGEs與糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結合產生大量活性氧簇（reactive oxygen series，ROS），ROS使氧化還原敏感性轉錄因子活化和糖酵解過程中間產物增加，進而促進AGEs的生成。高血糖狀態時，AGEs生成明顯增加，AGEs結合一氧化氮（nitrogenoxide，NO）后可產生抑制作用，導致神經缺血改變。在外周神經組織中，AGE的產生及AGE-RAGE系統的作用可進一步刺激炎基因的轉錄和氧化應激的發生，最終出現糖尿病外周神經結構異常和神經功能的障礙[6]。研究[6]證明，AGEs可以引起微管蛋白和神經絲的改變，從而影響軸突的運輸，而軸突運輸的中斷可促使神經纖維發生萎縮和退化。PARP途徑在DPN發生發展過程中也與氧化應激有一定的聯合作用。高血糖時，游離基團及氧化劑刺激了PARP活化，而被激活的PARP也會引起氧化應激。最近的研究已表明，DM患者高血糖狀態可誘導周圍神經系統產生氧化應激效應，激活PARP-1，影響細胞能量代謝、信號轉導和神經軸突轉運，導致神經細胞代謝障礙或死亡，是DPN的進展的重要因素之一[7]。

DPN屬中醫“消渴”兼癥，是由消渴日久，內熱傷陰耗氣，氣虛無力運行血脈，陰虛脈絡不榮瘀滯，陰損及陽，陽虛寒凝，血液凝滯，脈絡瘀阻所導致。治療上常將益氣養陰與活血通絡相結合，標本兼治。本研究所用益氣養陰通絡復方芪歸糖痛寧顆粒，主要由黃芪、當歸、生地黃、延胡索、葛根、雞血藤、威靈仙等組成。以黃芪大補脾胃之氣，旨在令氣旺血行而瘀去絡通；當歸藥性甘緩，補血行血，祛邪而不傷正，二者同用，共為君藥；葛根升陽、生津止渴，生地清熱涼血，養陰生津，助黃芪、當歸益氣活血生津為臣藥；雞血藤活血補血，延胡索辛散活血、行氣、止痛共為佐藥。威靈仙祛風通絡而止痛，使十二經脈通行順暢，藥性直趨病所，為使藥。諸藥合用，氣血同治，標本兼顧，具有益氣養陰、活血通絡之功，防治和延緩DPN，改善DPN臨床癥狀，標本同治，諸藥共濟[2]。

本研究結果顯示，干預12周后，芪歸糖痛寧顆粒能夠降低糖尿病大鼠血糖，改善神經傳導速度，升高血清SOD、NGF水平，降低MDA水平，下調坐骨神經AGEs、PARP mRNA表達水平，提示芪歸糖痛寧顆粒能夠綜合控制氧化應激與AGEs生成途徑及PARP途徑的聯合作用對DPN的影響，保護神經系統，從而有效防治DPN。

［1］管凌志.前列地爾聯合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經病變37例［J］.臨床醫學，2015，24（1）：76-78.

［2］方朝暉，趙進東.芪歸糖痛寧顆粒治療糖尿病周圍神經病變的臨床觀察［J］.中醫藥臨床雜志，2012，24（2）：126-128.

［3］賁瑩，張風華，梁文杰，等.不同黃芪劑量補陽還五湯對糖尿病大鼠神經功能及氧化應激的作用［J］.中成藥，2015，37（1）：199-201.

［4］魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學［M］.第4版.北京：人民衛生出版社，2010：212.

［5］季文博，高家榮，姜輝，等.芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病周圍神經病變大鼠的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（6）：113-115.

［6］鮑偉杰，張文健，許世清，等.AGE-RAGE系統在糖尿病神經病變中的作用［J］.生理科學進展，2014，45（2）：137-138.

［7］陳靜芬，李強.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1與糖尿病慢性并發癥［J］.臨床薈萃，2014，29（2）：238.

（收稿：2016-07-11修回：2016-10-20）

Effect of Qigui Tangtongning Granules(QTG)on the Expression of Advanced Glycation End Products and Poly ADP-ribose Polymerase mRNA in Sciatic Nerve of Diabetic Rats

CUI Liqun1,FANG Zhaohui2,LUO Yun1.1 Department of Endocrinology,Chinese Medical Hospital of Yuhang,Hangzhou,Hangzhou(311106),China; 2 Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine,Hefei(230031), China

Objective To investigate the effect of Qigui Tangtongning Granules（QTG）on diabetic peripheral neuropathy（DPN）.Methods Sixty-five SD rats were used in this study.Fifty-five of those were fed with high fat diet for 4 weeks,then fasted for 12 h before intraperitoneal injection of 60 mg/kg STZ to induce the model of type 2 diabetis.Forty-two models were successfully established and random ly divided into model group（n=9）,highdose QTG group（n=11）,low-dose QTG group（n=11）,and mecobalamine group（n=11）.The corresponding drugs were administered by gavage.The rest 10 rats serviced as controls.Control group and model group were given citric acid buffer solution.The course of treatment was 12 weeks.At the end of the experiment,fasting plasma glucose was detected,the nerve conduction velocity was measured,serum superoxide dismutase（SOD）,malondialdehyde（MDA）and nerve growth factor（NGF）were determined,and the expression of advanced glycation end products（AGEs）and poly ADP-ribose polymerase（PARP）mRNA in sciatic nerve was assessed.Results Compared withmodel group,high-dose and low-dose QTG groups decreased levels of FPG（14.08±3.54mmol/L and 16.11±2.95mmol/ L vs 20.41±2.25mmol/L,P＜0.01 or P＜0.05）,improved the nerve conduction velocity in diabetic rats（49.16±5.37m/s and 43.76±3.93m/s vs 39.66±3.65m/s,P＜0.01 or P＜0.05）,reduced serum MDA（14.91±1.23nmol/L and 15.22±0.55nmol/L vs 16.75±1.67nmol/L,P＜0.05）,AGEs mRNA（0.572±0.021 and 0.983±0.013 vs 1.088±0.032；P＜0.01）,and PARP mRNA（0.677±0.035 and 0.829±0.015 vs 1.113±0.024,P＜0.01）,meanwhile high-dose QTG group increased serum SOD（112.87±4.98U/mL vs 97.55±4.93U/mL,P＜0.01）and serum NGF（37.38±4.51ng/L vs 26.06±4.41ng/L,P＜0.01）. Conclusion QTG can inhibit the interaction of oxidative stress and the pathway of AGEs and PARP to improve the structure and function injury of nerves,so as to prevent and treat diabetic peripheral neuropathy.

rats;diabetic peripheral neuropathy;Qigui Tangtongning Granule;AGEs;PARP

國家中醫藥管理局中醫藥重點學科——內分泌學（No.20091221）

1杭州市余杭區中醫院內分泌科（杭州311106）；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科（合肥230031）

崔李群，Tel：18157187919；E-mail：779557148@qq.com