植物雌激素防治骨質疏松作用的機制進展

王冬生 韓婧 康文博 趙建寧*

1.第二軍醫大學南京臨床醫院南京軍區南京總醫院骨科，南京 210002 2.第四軍醫大學藥理學教研室，西安 710032

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特征的一種系統性、全身性骨骼疾病，同時OP又是骨衰老導致的退行性疾病[1]。據統計，全球OP患者超過2億，在世界常見病的發病率排行第7名，在中國乃至全球都是一個值得關注的健康問題。OP可分為原發性和繼發性兩種，其中原發性骨質疏松占骨質疏松的90%，又可分為2種亞型，即I型和II型(I型又稱絕經后骨質疏松，II型為老年性骨質疏松)。其中，I型骨質疏松又占原發性骨質疏松的絕大多數，I型骨質疏松發病主要由于絕經后婦女合成和分泌雌激素的能力下降、成骨細胞形成減少、成骨功能減退、破骨細胞形成和募集增加、破骨作用(骨吸收)增強。骨形成和骨吸收之間出現負平衡，使骨量減少，從而發生骨質疏松癥[2]。

目前臨床防治骨質疏松藥物的主要理論基礎包括：1.抑制破骨細胞過量的骨吸收，抑制絕經后骨質疏松癥患者和其他的骨代謝障礙所導致的高骨轉換率；2.刺激成骨細胞骨形成和礦化成熟，同時也抑制破骨細胞增殖分化，使新骨的形成超過吸收最終使得骨量增加。其作用的靶點主要針對成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收。

植物雌激素(phytoestrogens)，一類天然存在于多種植物中的非甾體類化合物，在結構和功能上與內源性雌激素相似，能與體內雌激素受體(estrogen receptor，ER)選擇性結合，通過調節雌激素受體具有雌激素樣作用[3]。植物雌激素可以調節骨代謝(骨重建)平衡、促進成骨細胞的骨形成、抑制破骨細胞的骨吸收、誘導和調控骨髓間充質干細胞(BMSCs)向成骨細胞分化方面有著重要作用。其主要用于絕經后婦女和老年性骨質疏松，但對子宮和乳腺等雌激素受體陽性的組織器官不會產生刺激增生等副作用，從而在骨質疏松的防治中引起廣泛關注。本文從植物雌激素的植物來源、結構類型及防治骨質疏松中的作用機制等方面的研究進展進行綜述，為臨床治療骨質疏松癥提供新策略、新方法。

1 植物雌激素的植物來源及結構類型

植物雌激素是能與機體雌激素受體結合，調節機體代謝的一類次生代謝產物。廣泛分布于豆科植物中[4]，也分布于莧科、鳶尾科、桑科及薔薇科等。其結構類型主要為黃酮類(包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮等，其中以異黃酮類為主)，木脂素類，香豆素類及其它類型等。

1.1 植物來源

植物雌激素主要分布在豆科植物中，其主要的植物來源見表1。

表1 植物雌激素在豆科植物中的分布[5]Table 1 Distribution of phytoestrogens in the legume

此外，亞麻科亞麻(LinumusitatissimumL.)，小檗科淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)，五加科人參(PanaxginsengC.A.Mey.)，傘形科柴胡(BupleurumchinenseDC.)和蛇床(CnidiummonnieriL.Cuss.)，石蒜科仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)，石竹科王不留行(Vaccariasegetalis(Neck.) Garcker)，莎草科莎草(CyperusrotundusL.)，鳶尾科射干(Belamcandachinensis(L.) Redouté)，茜草科巴戟天(MorindaofficinalisHow)，大麻科啤酒花(HumuluslupulusLinn.)，薯蕷科山藥(DioscoreaoppositaThunb.)，毛茛科黑升麻(CimicifugaracemosaL.Nutt.)，銀杏科銀杏(GinkgobilobaLinn.)等均含有植物雌激素類成分。

1.2 植物雌激素的結構類型

1.2.1異黃酮類(isoflavone)：異黃酮類植物雌激素[6]是以3-苯基苯并吡喃酮為母核的多羥基酚類化合物，主要的活性化合物包括：大豆黃酮(daidzein)，染料木黃酮(genistein)，黃豆黃素(glycitein)、刺芒柄花素(formononetin)、鷹嘴豆芽素A(biochanin A)、黃腐酚(xanthohumol)、異黃腐酚(isoxanthohunol)、補骨脂二氫黃酮(bavachin)、新補骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)、異補骨脂查爾酮(isobavachalcone)、葛根素(puerarin)、淫羊藿苷(icariin)、山柰酚(kaempferol)、光甘草定(glabridin)和光甘草素(glabrene)等。

圖1 異黃酮類植物雌激素的結構類型及主要活性化合物Fig.1 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of isoflavone phytoestrogens.

1.2.2木脂素類(lignan)：木脂素類植物雌激素為一類主要通過對羥基苯乙烯單體氧化耦合而成的化合物，包括：開環異落葉松樹脂酚(secoisolariciresinol)、羅漢松脂素(matairesinol)、落葉松樹脂醇(lariciresinol)、松脂酚(pinoresinol)、異落葉松脂素(isolariciresinol)、梣皮樹脂醇(medioresinol)、丁香脂素(syringaresinol)、去甲二氫愈創木酸(nordihydroguaiaretic acid)和脫水開環異落葉松脂酚(anhydrosecoisolariciresinol)等[7]。

圖2 木脂素類植物雌激素的結構及主要活性化合物Fig.2 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of lignan phytoestrogens.

1.2.3香豆素類(coumarins) ：香豆素類植物雌激素是結構中具有苯并α-吡喃酮母核為基本骨架特征的順式鄰羥基桂皮酸內酯類化合物，其中雌激素樣化合物有擬雌內酯香豆雌酚(coumestrol)、蛇床子素(osthole)、異歐前胡素(isoimperatorin)、補骨脂素(psoralen)、異補骨脂素(isopsorlen)及其糖苷補骨脂苷(psoralenoside)和異補骨脂苷(isopsoralenoside)等[8]。

圖3 香豆素類植物雌激素的結構及主要活性化合物Fig.3 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of coumarin phytoestrogens.

1.2.4其他結構類型的植物雌激素：除上述3種類型的植物雌激素外，二羥基苯酸內酯類的α-玉米赤霉素(α-zearalanol，α-ZAL)，茋類化合物白藜蘆醇(resveratrol)，王不留行中的環肽segetalin A、B、G、H，蒽醌類化合物大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)、大黃酸(rhein)、大黃素甲醚(physcion)，廣藿香烷型倍半萜香附子烯(cyperene)，甾醇類的β-谷甾醇(β-sitosterol)、蛻皮甾酮(ecdysterone)，三萜類的人參皂苷(ginsenoside)、三七皂苷(notoginsenoside)、柴胡皂苷(saikosaponin)、黃芪皂苷(astragalosaponin)等其他類型化合物。

2 植物雌激素在防治骨質疏松過程中的作用機制

雌激素對骨代謝的調節有直接作用和間接作用[9]，其間接作用主要體現為：提高1α羥化酶活性，增加1，25-(OH)2D3合成，促進骨形成；促進降鈣素(CT)分泌，抑制骨吸收；調節骨對甲狀旁腺激素(PTH)敏感性或減少低鈣對PTH的刺激，從而抑制PTH分泌，抑制骨吸收。目前，在成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)中均發現了雌激素受體(ER)的存在。故雌激素可直接作用于OB、OC上的ER抑制骨吸收，調節骨代謝[10]。天然異黃酮類物質具有雌激素樣作用，能夠抑制骨吸收，促進骨形成，維持骨代謝的動態平衡[11, 12]，還可以通過調節骨髓間充質干細胞成骨分化及骨質疏松相關信號通路[13]：ER、絲裂原蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)[14, 15]、過氧化物酶增殖子受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)[16, 17]、Wnt[18, 19]和Sirt1[20]等信號通路，促進成骨細胞的分化、增殖，對抗骨質疏松，從而有望成為一種新型的治療骨質疏松的藥物。

2.1 具有雌激素樣作用

植物雌激素是一類存在于植物中，能與機體雌激素受體(ER)結合，產生雌激素樣作用的非甾體類化合物。研究發現，大豆異黃酮能夠抑制絕經后骨質疏松，增加骨骼強度，降低骨折風險[21]。植物雌激素抗骨質疏松的機制可能是通過雌激素受體α(ERα)途徑調節成骨細胞形成、分化和轉錄因子，如骨形態發生蛋白，核心結合因子等的表達，增加成骨細胞的增殖和骨形成作用；以及通過雌激素受體途徑調控骨代謝的RNKLRNK-OPG系統，抑制破骨細胞的形成、分化和骨吸收作用，維持成骨細胞和破骨細胞之間的動態平衡，減少骨質的丟失。植物雌激素的生物活性約為雌激素的1/500-1/1000，副作用較小，主要用于絕經后婦女和老年性骨質疏松，但對子宮和乳腺等雌激素受體陽性的其他組織器官不會產生刺激增生等副作用。而且可以與機體中的鈣有機結合，促進1,25-二羥基維生素D3的合成，增加腸道對鈣的吸收，有效彌補了補鈣吸收率低的弊端，從而在骨質疏松的防治中引起廣泛關注。

2.2 促進BMSC成骨分化

近年來干細胞在再生修復和治療方面顯示出較好的應用前景，Wallace和Takako基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老齡性骨質疏松與骨髓間充質干細胞功能不良的相關性，提示一些關鍵基因在骨髓間充質干細胞的成骨向分化中起重要作用，其缺失可導致骨質疏松疾病發生[22-25]。骨髓間充質干細胞(BMSC)是成骨細胞的前體細胞，在骨形成及骨質疏松的過程中起著不可替代的作用[26]。臨床研究證明，通過移植BMSCs能夠在一定時間內使成骨不全患者的骨骼生長速度加快、骨密度增高、骨折發生率下降[22]。已有研究表明，植物雌激素在BMSCs骨代謝和生物學特性維持方面有特殊的貢獻，通過抑制PPARγ(過氧化物酶體增殖物激活受體γ)和C/EBPα(CCAAT增強子結合蛋白α)尤其是TFs Runx2(成脂轉錄因子Runx2)和Sp7，調節ER通路及Wnt/β-catenin和Sirt1通路促進BMSCs成骨分化[27]。

2.3 參與調節與骨質疏松相關的信號通路

研究表明，植物雌激素防治骨質疏松作用的分子機制主要涉及ER、MAPK、PPARγ、Wnt和Sirt1等信號通路：植物雌激素通過結合并激活ERα和ERβ發揮骨保護作用；激活細胞膜ER引起細胞內MAPK的激活；可以抑制以PPARs介導的作用，抑制脂肪生成、促進骨生成；Wnt信號通路可促進成骨細胞的分化、增殖、存活，是成骨細胞的正調節蛋白；Sirt1與骨代謝、骨量關系密切，組蛋白的去乙酰化修飾可抑制骨形成，降低成骨細胞中骨鈣素和堿性磷酸酶的表達，減少成骨細胞的增殖、分化。植物雌激素通過調節骨質疏松相關信號通路，促進骨形成，抑制骨吸收，達到防治骨質疏松的效果。

2.3.1ER通路：雌激素(Estrogen)是一類女性荷爾蒙，屬于性類固醇激素。雌激素受體分為兩大類：細胞核內的ERα和ERβ，核受體的膜性成分及屬于G蛋白耦聯受體家族的GPR30，Gaq-ER，ER-X[28]。雌激素通過促進成骨細胞增殖和破骨細胞凋亡，發揮抗骨質疏松的作用[29]。植物雌激素可直接參與機體的內分泌調節，一定劑量的植物雌激素在體內能夠與ER結合，發揮雌激素樣作用。當植物雌激素使用足夠的劑量時，可以產生與體內17β-雌二醇相似的效能[30, 31]。食物中的植物雌激素在防治更年期綜合征、絕經后骨質疏松癥等方面有類似雌激素替代療法(ERT)的積極作用[32]。不同種類的植物雌激素與雌激素受體結合的親合力不同而顯示出不同的作用效能。研究表明，異黃酮類化合物能使ERβ的AF-2表面更易于結合共調節因子，從而對靶基因具有ERβ依賴性的轉錄調節作用[33]。

雌激素缺乏時，骨代謝轉換亢進，骨吸收超過骨形成，使血清中白細胞介素1，6(IL-1, IL-6)和腫瘤壞死因子β(TNF-β)增加。IL-1，IL-6均可刺激破骨細胞前體細胞的生成和分化，并使破骨細胞活性增加而促進骨吸收，TNF-β是骨吸收誘導劑。植物雌激素通過ER發揮生物效應，抑制這些細胞因子的產生，防止骨量減少[34]。染料木素[35]、黃豆黃素、白藜蘆醇、人參皂苷、槲皮素和香豆雌酚等植物雌激素，通過調節ERα或ERβ與其他信號通路間的相互聯系調節BMSCs的成骨、成脂分化[27]，維持BMSCs的骨代謝平衡，抑制骨質疏松發展。

2.3.2MAPK和ERK信號通路：絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)是真核生物細胞內廣泛存在的一類介導細胞反應的重要信號傳導系統[36]。該通路包括三種核心激酶(MAP3K、MAPKK和MAPK)，以及可能存在的上游(MAP4K)和下游組件(MAPKAPK)。MAPK信號通路主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路。研究表明，膠原蛋白水解物可以刺激ERK1/2磷酸化，促進成骨細胞(osteoblast，OB)分化和增殖，腰椎骨密度(bone mineral density，BMD)增加，由此可見ERK1/2與骨質疏松的治療有關[37]。JNK-Fra-1通路在水溶珍珠素(water soluble nacre factor，WSNF)誘導的OB礦化過程中發揮重要作用[38]，表明JNK通路與骨形成有關。骨形態發生蛋白(BMP)通過激活p38 MAPK-Smad信號通路增強C2C12細胞成骨分化和礦化。P38通過增加OB生成和減少破骨細胞(osteoclast，OC)分化改善骨質疏松[39]。由此可見，MAPK通路在骨質疏松發病機制中發揮重要調節作用。

染料木素呈時間、劑量依賴性調節磷酸化P38 MAPK信號通路來刺激鼠初級MSCs骨發生，但其產生的成骨分化卻不需要ERK1/2信號調節。通過抑制ERK1/2磷酸化，使成脂標志物表達減少(PPARγ，C/EBP，FABP4的蛋白水平和脂質囊泡的積蓄)以及減少脂肪形成，特異性的激活下游的信號通路提高成骨分化[40]。MG-63細胞中加入25μg/ml和50μg/ml Kobophenol A，發現磷酸化P38顯著增加，cyclin B1和CDK1蛋白表達增加，G2M期細胞比例顯著增加[41]。以上研究表明，植物雌激素可以通過激活MAPK通路促進骨形成，對抗骨質疏松的發展。

2.3.3PPARγ信號通路：轉錄因子PPARγ作為類固醇激素膜受體PPAR的亞家族，能夠調整MSC分化形成脂肪細胞。PPARγ信號通路能夠被PPARγ受體激動劑與拮抗劑間接調節，也能通過上游抑制物來減少PPARγ和C/EBP mRNA的表達[42]。在沒有成骨性因子時，PPARγ抑制不是骨發生刺激物所必須。劍麻皂素能夠通過抑制PPAR γ和p38 MAPK信號通路促進骨髓間質細胞成骨分化[27, 43]。牛至屬提取物黃酮類化合物為PPAR調節劑，可以抑制PPARγ蛋白進而影響脂肪形成[44]。桔梗皂苷通過調控上游的脂肪細胞分化靶點(Krueppel-like factor 2 (KLF2))抑制PPARγ的表達[45]。此外，白藜蘆醇產生的sirtuin(sirt)信號通路顯示刺激內皮細胞KLF2的表達，在MSCs下調PPARγ表達會產生聚集植物雌激素的作用，sirt信號通路和調節甲羥戊酸通路[46]。由此可見，植物雌激素通過PPAPγ信號通路可以調節MSCs脂肪形成，對抗骨質疏松。

2.3.4Wnt/β-catenin通路：Wnt信號通路在無脊椎動物和脊椎動物發育過程中起關鍵作用，參與了細胞增殖、分化、凋亡和胚胎發育中細胞定位控制等過程。研究證實，Wnt信號通路可促進成骨細胞的分化、增殖、存活，是成骨細胞的正調節蛋白[47]。激活Wnt通路可抑制破骨細胞活性，下調RANKL，增加骨保護素的表達[48]。Wnt 通路的主要內源性調節因子是硬化蛋白，由骨細胞分泌，通過與Wnt 配體上LRP-5 和LRP-6 受體結合特異性抑制Wnt 通路的活化，最終抑制骨量形成[49]。目前，硬化蛋白抗體被用于治療骨質疏松臨床研究。DKK-1 作為Wnt信號通路的抑制因子可抑制骨形成[50]。許多骨量丟失疾病患者的血清DKK-1含量升高，因此，通過抑制DKK-1的活性來治療骨量丟失疾病成為近年來的研究熱點[51]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵信號分子，可以促進間充質干細胞向成骨細胞分化[52]。分泌型卷曲相關蛋白1(secreted Frizzled-related protein-1，sFrp-1)家族是一組與Wnt 受體Frizzled相關的蛋白，在各種組織中廣泛表達，可直接與Wnt配基結合以抑制Wnt/β-catenin信號通路[53]。其中sFrp-1與骨質疏松間的關系最為密切[54]。sFrp-1基因敲除小鼠的成骨細胞活性增強，多處骨組織表現出松質骨骨密度、骨量和礦化率的上升[55]。

已有研究表明，印度黃檀中的異黃酮類植物雌激素可以通過激活BMP2和Wnt/β-catenin信號通路，促進MSCs成骨分化。生姜中的二芳基庚烷類植物雌激素可以激活GSK-3β的磷酸化，激活Wnt/β-catenin信號通路，防止骨流失。Wnt信號通路在骨形成中的重要作用，而植物雌激素對其通路中的眾多蛋白的調控也成為治療骨質疏松的潛在靶點，為治療骨質疏松帶來新希望。

2.3.5Sirt1信號通路：Sirt1 是哺乳動物沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，Sir2)同源蛋白(Sirt1-7)中與酵母菌Sir2同源性最高的，也是第1個被發現的Sirtuin蛋白家族成員[56]。近年來研究發現，Sirt1 在骨質疏松癥的發病、防治中同樣發揮重要作用[57]。Sirt1 在成骨細胞的大量表達與提高老齡鼠骨密度有重要意義。Sirt1與骨代謝、骨量關系密切，組蛋白的去乙酰化修飾可抑制骨形成，降低成骨細胞中骨鈣素和堿性磷酸酶的表達，減少成骨細胞的增殖、分化[20]。Sirt1敲除小鼠(Sirt1胚系突變的129/Sv小鼠)與野生型(Sirt1+/+)小鼠相比，Sirt1單倍體(Sirt1+/-)小鼠骨量、骨小梁數目、股骨體積分數、第4腰椎骨礦物質含量顯著減少，雌性小鼠表現尤為突出；骨形成明顯減少，礦化沉積率和骨形成率降低[58]。在去卵巢小鼠的骨髓中，還發現Sirt1 蛋白水平的降低伴隨著骨髓脂肪細胞的增加[59]。

已有研究表明，Sirt1的激活劑白藜蘆醇促進成骨細胞的分化，減少骨髓脂肪細胞的形成和破骨細胞的數量[60]。白藜蘆醇在骨髓間充質干細胞(MSCs)向成骨分化中能促進Sirt1 與PPAR-γ結合，抑制PPAR-γ的活性，阻礙MSCs向脂肪細胞分化，促進骨形成[61]。PPAR-γ還可抑制Runx2 mRNA 的轉錄活性及成骨信號通路，包括Wnt 和轉化生長因子β/BMP等[62]。Runx2是啟動成骨轉錄程序的早期主要的轉錄因子，可誘導成骨細胞特異性基因的表達，如骨橋蛋白、骨鈣素和堿性磷酸酶等。為與白藜蘆醇具有相似作用的植物雌激素，通過Sirt1/Runx2信號通路調節MSCs成骨成脂分化平衡，臨床治療骨質疏松提供可能。

植物雌激素作為一種選擇性的雌激素受體調節劑，與雌激素相比，其副作用相對較小，已在抗癌，防治心血管疾病，防治更年期綜合癥，抗骨質疏松、改善認知，防治代謝綜合征等多方面，顯示出了良好的應用前景。然而，植物雌激素的生物活性受多種因素的影響，如體內代謝途徑，劑量，內源性雌激素水平，與其他藥物及食物成分的相互作用等。而且，關于植物雌激素防治骨質疏松方面的研究，仍有許多問題需要探討，如生物活性研究缺乏統一的評價標準，不良反應研究較少，作用機制研究不夠系統，根據其結構特征判斷化合物的雌激素樣作用也不夠全面。因而，還需要從細胞、整體動物和臨床試驗等各個方面，探討植物雌激素在防治骨質疏松中在作用，為植物雌激素的臨床應用提供科學依據。