低分子量褐藻糖膠對破骨細胞凋亡的影響

金鑫 朱立國 李秀蘭 賈建 張揚 孫曉雷 馬劍雄 李風波 馬信龍*

1. 天津市天津醫院骨科研究所，天津 300211 2. 中國中醫科學院，北京 100102

褐藻多糖硫酸酯是一類從海帶中提取的天然硫酸化多糖，其主要成分為褐藻糖、硫酸根以及少量糖醛酸、半乳糖和木糖。國內外大量研究表明，褐藻糖膠具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等[1]。骨重建是成骨細胞與破骨細胞共同參與的過程，骨形成與骨吸收的失衡是導致骨質疏松癥和骨硬化癥等疾病的重要病因。成骨細胞參與骨形成，破骨細胞參與骨吸收。因此，破骨細胞的凋亡直接影響骨吸收，從而影響骨重建過程。大量研究證實柚皮苷可以促進成骨細胞的增值、分化成熟；提高骨密度、提升骨骼力學性能，防治去勢大鼠骨質疏松[2-4]。但褐藻糖膠對破骨細胞凋亡的影響尚未見報道，本實驗通過在體外LMWF對RANKL誘導的成熟破骨細胞的作用，觀察LMWF對破骨細胞凋亡的影響以及其機制，為LMWF抗骨質疏松在破骨細胞方面提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

小鼠單核細胞RAW264.7細胞株(中國協和醫科大學基礎醫學細胞中心)；褐藻糖膠，(Sigma公司)；牛皮質骨(自制)；小鼠重組可溶性核因子кB受體活化因子配體(sRANKL)(Peprotech公司)；capsase-3活性測試試劑盒(南京碧波公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(Sigma公司)；高糖DMEM培養基、10%胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(Sigma 公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、D-hank’s液(自制)；All-in-OneTM qPCR Mix、All-in-OneTM qPCR Primer (美國 GeneCopoeia公司)。

1.2 儀器

掃描電子顯微鏡；細胞培養皿(Corning 公司)；倒置相差顯微鏡、CX-21 光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；5%CO2細胞培養箱(Heraeus 公司)；流式細胞儀及相關分析軟件(BD公司)；iQ5 Real Time PCR檢測洗脫(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1薄骨片制備：粗切獲取牛股骨的皮質骨，沿著股骨的長軸方向切取厚約100 μm的皮質骨骨片，細砂紙將骨片打磨平滑，修剪成0.5 cm×0.5 cm大小的正方形，紫外線消毒正反面過夜， 75%乙醇浸泡30 min，無菌D-hank’s液清洗3遍，放置于培養基中，置于4 ℃備用，用時取出晾干。

1.3.2破骨細胞誘導與鑒定：(1)誘導：將RAW264.7單核細胞株接種于6孔板上的預置無菌玻片和薄骨片上，細胞接種密度2×104/mL，4 h后待細胞貼壁，換為濃度為100 ng/mL RANKL的10%FBS高糖DMEM培養基，37℃、5%CO2的培養箱中培養，每兩天換液1次。(2)鑒定：誘導5 d后，①倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態特征；②TRAP染色：將玻片取出，用檸檬酸鹽/丙酮溶液固定30 s，在以萘酚AS-BI磷酸鹽作為底物的孵育液中37 ℃孵育1 h，蒸餾水洗3次，蘇木精復染2 min，干燥后二甲苯透明，封固后光鏡觀察抗酒石酸酸性磷酸酶陽性多核破骨細胞(≥3個核)。③骨吸收陷窩：先用胰蛋白酶和EDTA將薄骨片上的破骨細胞消化，2.5%的戊二醛固定30 min，PBS超聲清洗3次，每次5 min，30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，CO2臨界點干燥，噴金后掃描電鏡觀察骨吸收陷窩。

1.3.3TRAP陽性細胞計數與骨吸收面積分析：實驗分為空白組和低分子量褐藻糖膠組，按照上述的方法誘導5 d后，LMWF組采用含有5 ng/mL LMWF培養基進行誘導3 d后取出玻片，進行TRAP染色(方法同上)。計數標準：①兩組分別在100倍視野下隨機選取10個視野進行計數，取平均值；②細胞呈現玫瑰紅色或粉紅色，細胞核≥3個，上述實驗重復3次。骨吸收陷窩操作方法同上，兩組各10張薄骨片，每張骨片隨機選取10個區域，區域之間無重疊，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對骨吸收面積進行分析。

1.3.4吖啶橙染色：RAW264.7細胞株以2104/mL密度爬片，100 ng/mL RANKL誘導5 d后，換為含有5 ng/mL LMWF的培養基繼續培養48 h，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定5 min，醋酸酸化30 s，PBS清洗1 min；加入0.01%吖啶橙染液5 min，PBS清洗，用0.1 mol/LCaCl2分色2 min, PBS 緩沖液清洗3次(10 s/次)。以PBS 緩沖液做介質封片, 用激發濾板BG-12, 阻斷濾片波長 515 nm，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡：細胞誘導培養5 d后，換為含有LMWF的培養基繼續培養2d后，胰酶消化，與培養液一起收集，離心5 min(1500 r/min)。培養液洗滌細胞1次，之后用PBS洗滌1次，以 1×106/mL密度重懸細胞于結合緩沖液。取100μL細胞加入2μL Annexin V-FITC和10 μL PI(propidium iodide)。設置以下3組用于調試流式細胞儀：①不加 Annexin VFITC 也不加 PI；②加 Annexin V-FITC不加 PI； ③加 PI 不加 Annexin V-FITC。輕輕混勻后室溫避光反應 15 min后，補加 400μL 結合緩沖液，流式細胞儀檢測結果。

1.3.6caspase-3活性測定：細胞誘導培養5 d后，換為含有LMWF的培養基繼續培養3 d后，胰酶消化，離心(2000 r/min，5 min)，吸除上清，PBS清洗1次。加入50 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，其間渦旋振蕩3次(10 s/次)。4℃離心(12000 r/m，10 min)，小心吸取上清液(含裂解的蛋白質)轉移至新的管中，按照試驗說明書的反應體系進行加樣。用酶標儀在405 nm波長處測定其吸光值(OD)。計算caspase-3的活性單位，飽和底物濃度下1個酶活力單位在37℃每小時可以剪切1 nmol/L Ac-DEVE-pNA 產生1 nmol/L pNA 的caspase-3的酶量。計算結果顯示為各組相對于對照組的相對量。

1.3.7熒光定量PCR檢測相關基因表達：細胞誘導培養5 d后，換為含有LMWF的培養基繼續培養3 d，之后將兩組細胞采用胰酶消化，收集細胞，加1 mLTRIzol溶液，振蕩混勻。采用相分離技術抽提取RNA，瓊脂糖電泳法檢測：BCL-2與BAX基因濃度及完整性。各組檢測基因反轉錄為 cDNA，以 GAPDH為內參基因，引物由廣州復能基因有限公司設計。基因引物序列：GAPDH 正向引物正向引物5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’，擴增片段為 96 bp； BCL-2正向引物5’-ACGGGGTGAACTGGGGGAGG-3‘反向引物5’-GCATGCTGGGGCCGTACAGT-3’，BAX正向引物5’-GATGGACGGGTCCGGAGA-3’反向引物5’-CTCAGCCCATCTTCTTCCAG-3’逆轉錄反應體系、PCR 擴增體系以及反應條件按照試劑盒說明書設定。反應完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析。基因表達量以檢測基因的初始模板量以 2-△△Ct表示。

2 結果

2.1 TRAP陽性細胞計數與骨吸收面積分析

由圖1A，1B可見，RANKL誘導5 d后，加入含有LMWF的培養液(LMWF濃度5 ng/mL)繼續誘導培養3 d，進行TRAP染色。空白組成熟破骨細胞數量比較多于柚皮苷組，且細胞核較多；經統計學比較，P<0.05，有差異。由圖1C、1D可見對照組骨吸收陷窩數目較多，骨吸收總面積較大；而LMWF組骨吸收數目少，總面積小，經統計學比較，P<0.05，有差異。提示LMWF可以抑制破骨細胞的活性以及骨吸收功能，見表1。

2.2 吖啶橙染色結果

吖啶橙可以非特異性的結合細胞核的核酸，在592 nm波長激發光下顯黃色熒光，圖2A正常的破骨細胞吖啶橙染色淺淡，細胞核大小均勻、染色質分布均勻；圖2B凋亡的破骨細胞吖啶橙著色較深，細胞核濃縮，細胞核大小不均、染色質分布不均。提示LMWF能明顯的促進成熟破骨細胞的凋亡。

圖1 LMWF對破骨細胞TRAP染色與骨吸收陷窩的影響1A為對照組，1B為LMWF組，1C為對照組，1D為LMWF組Fig.1 Effect of LMWF on TRAP staining and resorption pits1A, 1C: Control group; 1B, 1D: LMWF group

組別樣本數目(n)TRAP陽性細胞數目(n) 骨吸收面積μm2對照組529.4±3.23451.6±108.2LMWF組517.6±2.4?1972.4±96.4?

注：與空白對照組比較，*P<0.05

2.3 流式細胞術檢測LMWF對細胞凋亡的影響

破骨細胞經Annexin V與PI雙染后，進行流式細胞儀分析，得出四個象限。分別為Q1(左上)象限：為PI單陽性，代表細胞膜破壞而核膜存在的細胞，一般指機械損傷細胞；Q2(右上)象限為PI,V -FITC雙陽性，代表中晚期凋亡細胞和壞死細胞；Q3(右下)象限為V-FITC單陽性，代表早期凋亡細胞；Q4(左下)象限為雙陰性，代表活細胞。由圖2C、2D可見，與對照組相比，LMWF組破骨細胞的凋亡率明顯上升。

圖2 LMWF對破骨細胞凋亡的吖啶橙染色與流式細胞術Fig.2 Effect of LMWF on osteoclast apoptosis2A為對照組，2B為LMWF組，2C為對照組，2D為LMWF組2A, 2C: Control group; 2B, 2D: LMWF group

2.4 caspase-3活性的變化

RANKL誘導5 d后的破骨細胞中caspase-3活性隨時間延長逐漸增加；當5 ng/mL LMWF作用于誘導5 d后的破骨細胞24 h后caspase-3活性稍微升高；隨著作用時間的延長，caspase-3活性進一步上升，并在作用72 h后達到高峰。提示LMWF誘導破骨細胞凋亡的過程中，可提高caspase-3的活性，見圖3。

圖3 LMWF在不同時間點對破骨細胞caspase-3活性的影響注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Effect of LMWF on caspase-3 activity at different time pointsNote：*P<0.05 vs Control group；** P<0.01 vs Control group

2.5 對破骨細胞分化過程相關基因的表達情況

熒光定量PCR檢測各組BCL-2和BAX基因mRNA表達結果發現。與空白組比較，5 ng/mL LMWF組中成熟破骨細胞中BCL-2表達明顯減少，P<0.05，有統計學差異；BAX表達明顯升高，P<0.05，有統計學差異；BCL-2/BAX比值顯著下降，P<0.01，有統計學差異，見圖4。

圖4 LMWF處理后細胞中BCL-2與BAX mRNA表達水平的變化注：與對照組比較，*P<0.05，** P<0.01Fig.4 Expression of BCL-2 and BAX mRNA in osteoclasts after 72 h-treatment with LMWF detected using RT-PCRNote：*P<0.05 vs Control group；** P<0.01 vs Control group

3 討論

骨質疏松是以骨量減少、骨的微結構退變為特征，導致骨脆性增加容易發生骨折的全身性骨病[5]。在骨代謝過程中，破骨細胞對骨吸收起主要作用，陳舊骨折的吸收速率與時間長短主要由破骨細胞的活性和數量決定；破骨細胞是來源于單核巨噬細胞系統，成熟的破骨細胞有多個細胞核，細胞質中有大量的線粒體、高爾基體、溶酶體等特點，成熟破骨細胞不能進行有絲分裂，壽命約為14d左右[6-8]。目前破骨細胞的培養方法主要有兩種：①四肢長骨機械分離法：采用酶消化法分離提取動物四肢長骨的成熟破骨細胞，分離的破骨細胞骨吸收活性大，但數量較小，難以大量使用；②破骨樣細胞誘導培養法：采用RANKL、M-CSF等誘導單核細胞為成熟的破骨樣細胞，誘導得到的破骨樣細胞數量較多，但骨吸收活性稍弱[9-11]。由于本實驗需要大量的破骨細胞，因此采用了100 ng/mL RANKL誘導RAW264.7細胞株為成熟的破骨細胞，經破骨細胞特異性的TRAP染色和骨吸收功能成功的進行了鑒定，已有大量文獻證明[12-14]單獨100 ng/mL的RANKL即可誘導出成熟的破骨細胞。

褐藻糖膠是目前研究最多的非哺乳動物來源的，具有生物學活性的硫酸化多糖，主要存在于藻類和棘皮動物中。褐藻糖膠又稱巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯，是從褐藻中提取的一類硫酸多糖，主要位于褐藻的細胞壁基質中，占褐藻細胞壁干重的40%以上，是藻體維持體內濕度、防止體表干燥和保護其免受損傷的一種成分，為褐藻利用光能所必需。大量研究已表明褐藻糖膠具有廣泛的生物學活性，如具有調節血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、調節免疫和保護腎臟等作用[15]。

已經有報道[16]采用含有褐藻糖膠的骨支架，可以誘導成骨性，但褐藻糖膠對破骨細胞的影響尚未見報道。通過我們的實驗對TRAP(+)細胞計數發現LMWF可以減少RANKL誘導成熟破骨細胞的數量；應用掃描電子電鏡對薄骨片骨吸收陷窩掃描發現LMWF可以抑制破骨細胞的骨吸收功能，骨吸收陷窩數量與骨吸收面積顯著減少。提示LMWF不僅可以促進成骨細胞的分化、增值。同時能抑制破骨細胞的數量及骨吸收功能。

吖啶橙染色發現LMWF組的破骨細胞細胞核變小，染色質不均勻，細胞核著色較深，提示LMWF組的破骨細胞凋亡率明顯高于正常對照組的破骨細胞；流式細胞術Annexin V與PI雙染得出LMWF組早期凋亡破骨細胞明顯高于正常對照組，而中晚期凋亡細胞和壞死細胞與正常對照組無差異，提示LMWF具有促進破骨細胞的凋亡的作用。

Caspase家族是一組半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的啟動和完成中起重要作用，是細胞凋亡的執行者，決定了細胞凋亡的形態學改變和生物化學改變。Caspase的活化途徑有兩條：一條途徑是由死亡受體如Fas或TNFR介導的。另一條途徑由很多的促凋亡信號(如Bax)集中在線粒體水平，使細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，與Apaf-1(apoptosis protease acticating factor-1))結合, 進而激活Caspase-9，三者共同組成一個重要的效應Caspase的激活因子，接著逐步活化Caspase-3和Caspase-6、Caspase-7，產生Caspase的級聯放大反應[17-19]。Caspase-3處于凋亡Caspase級聯反應的下游，是最重要的效應型Caspase。 Caspase-3是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，是細胞凋亡性死亡的最終執行者，Caspase-3的活化說明凋亡進入不可逆階段[20]。本實驗研究發現LMWF可以明顯提高破骨細胞Caspase-3的活性，促進破骨細胞的凋亡。

凋亡相關基因中的BCL-2家族是細胞凋亡的關鍵調節因子，由抗凋亡和促凋亡成員協同作用，發揮著細胞凋亡開關的作用。BCL-2是B細胞淋巴瘤/白血病2基因的縮寫，能抑制細胞凋亡，其作用機制為：①抑制氧自由基；②影響細胞內細胞器的Ca2+內流；③干擾細胞色素C的釋放而阻斷Caspase蛋白酶的激活,抑制細胞凋亡；④影響其他誘導凋亡的基因,如BCL-2可抑制p53、 c-myc誘發的細胞凋亡[21]。BAX即BCL-2相關的X蛋白，可促進細胞凋亡， BAX基因的表達并不立即導致細胞凋亡，而是僅在細胞接受死亡信號之后BAX才可以開始發揮作用，通過抑制BCL-2的作用而導致細胞凋亡。BAX可以同BCL-2形成異二聚體，使后者喪失抑制凋亡的作用，從而導致細胞凋亡的發生[22]。研究發現細胞凋亡的發生與BCL-2/BAX比值有關，比值降低有利于破骨細胞發生凋亡[23]。 BCL-2/BAX降低，可引起線粒體膜電位的改變,進一步激活Caspase-3誘導細胞發生凋亡。BCL-2/BAX的相互抑制關系是細胞死亡的細胞內檢測點。在正常情況下, BCL-2和BAX在細胞內保持平衡。如果BCL-2相對量高于BAX,則促進形成BCL-2/BAX異二聚體，并使BCL-2同二聚體的量增多，從而抑制細胞凋亡；如果BAX相對量高于BCL-2，則BAX同二聚體的量增多，并抑制形成BCL-2/BAX異二聚體，從而促進細胞凋亡[24]。本實驗PCR結果發現，LMWF可以可下調Bcl-2基因的表達，上調BAX基因的表達，導致BCL-2/BAX比值降低，這可以促進了線粒體膜的通透性的下降，導致細胞色素C等促細胞凋亡因子向細胞質的釋放，最終激活Caspase-3誘導細胞發生凋亡。

綜上所述，本課題組認為，低分子量褐藻糖膠可以抑制破骨細胞的活性與骨吸收功能，促進破骨細胞的凋亡，其機制與線粒體凋亡途徑密切相關。本研究發現了褐藻糖膠在骨科中的用途，為海洋醫藥在骨科中的應用提供了基礎理論。