左歸丸、右歸丸對去卵巢骨質疏松大鼠神經肽CGRP、SP、VIP、NPY的影響

楊鋒 楊利學 李小群 李彥民

陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

神經系統(tǒng)調控骨的發(fā)育、修復的研究日益增多，業(yè)已證實神經肽降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、P 物質(substance P， SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)、神經肽Y (neuropeptide Y，NPY)與其受體構成神經肽網絡介導了神經系統(tǒng)與骨組織間信號的傳導，影響著骨的各種代謝變化，但它們與絕經后骨質疏松癥(osteoporosis,OP)關系以及補腎中藥調控機制的相關研究仍較少。左、右歸丸均出自《景岳全書》，是補腎陰和補腎陽的代表方劑。左歸丸由六味地黃丸化裁而成，去“三瀉”(澤瀉，茯苓，丹皮),加入枸杞、龜板膠、牛膝加強滋補腎陰之力；又加入鹿角膠、菟絲子溫潤之品補陽益陰，陽中求陰。右歸丸是將左歸丸去掉部分滋陰藥龜板膠和牛膝，再增加幾種辛溫補陽藥附子、杜仲、肉桂、當歸而成。即張介賓所謂：“善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭。善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮”之義。中醫(yī)在“腎主骨”理論指導下應用左、右歸丸治療骨質疏松癥取得了較好的療效。本文擬采用去卵巢方法誘導OP，分別觀察雌激素缺乏狀態(tài)下模型OP 大鼠骨組織及骨髓間充質干細胞中神經肽CGRP、SP、VIP、NPY及它們受體的分布與表達變化，并觀察左、右歸丸對神經肽的干預作用，進一步闡明補腎中藥復方的整體調節(jié)機理。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇SPF級SD大鼠60只，雌性8月齡，體重200±20 g,購自西安交通大學動物實驗中心(陜動質2013492)。DMEM(L) (Gibco,invitrogen,USA)、胎牛血清(FBS, Gibco, invitrogen, USA)、Total RNA 提取試劑盒(Promega)、RT-PCR Kit (invitrogen, USA)、mRNA引物(華大基因)、胰蛋白酶(Gibco,USA)、CO2孵箱(thermo, USA)

1.2 方法

1.2.1實驗動物的分組：動物稱重后隨機分組，將60 只大鼠隨機分為4 組，假手術組，模型組，左歸丸組、右歸丸組，每組15只。

1.2.2造模方法：模型組采用手術切除雙側卵巢的方法誘導OP 模型，稱重，麻醉后固定，術區(qū)消毒，取大鼠下腹部正中沿腹白線縱行切口約1 cm，打開腹腔，查找卵巢，結扎后切除兩側卵巢后縫合，假手術組開腹后切除少量脂肪保留卵巢。骨密度檢測：造模12 w應用雙能X 線骨密度儀檢測大鼠的骨密度，3%戊巴比妥鈉麻醉，雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司制造, Discovery ASY-00409型)檢測，采用小動物骨密度分析軟件分析。測定的部位選擇腰椎、股骨近側干骺端。藥物干預12 w后用同樣方法測量各組骨密度。

1.2.3給藥方法：左歸丸組成：熟地黃24 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、龜甲膠12 g、山藥12 g、牛膝9 g。右歸丸處方組成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、當歸9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、山藥12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分別加水煎制，并根據“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”計算臨床等效劑量，左、右歸丸組每天兩次灌胃給藥，每次1 mL，連續(xù)灌胃12 w周治療。模型組和假手術組給予等量的蒸餾水。

1.2.4BMSCs的分離、培養(yǎng)：采用全骨髓培養(yǎng)法取SD大鼠骨髓沖洗液，第2代培養(yǎng)細胞進行流式細胞儀檢測，結果顯示細胞均一性較好，其中CD34、CD45表達呈陰性,而CD90、CD105表達呈陽性，陽性率分別為93.136%和93.182%,提示培養(yǎng)所得細胞為主要是骨髓間質干細胞(BMSCs)，非造血性細胞。用細胞計數板作有核細胞計數，調整細胞濃度為5 ×104/mL,以備實驗之用。

1.2.5骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 表達量的檢測：取左側股骨近端相同部位的骨組織，稱重，研磨器液氮中勻漿，ELISA檢測CGRP、SP、VIP、NPY的表達量，采用免疫組化法觀察骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經分布。

1.2.6BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY 受體mRNA 的表達檢測：采用realtime 熒光定量RT-PCR檢測，骨組織稱重，研磨器液氮中勻漿，TRIZOL法提取總RNA；根據GenBank 注冊的大鼠基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計CGRP、SP、VIP、NPY的熒光定量PCR 引物；提取的RNA濃度測定；引物的合成；逆轉錄；定量PCR 實驗。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the genes

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

模型組與假手術組比較, 有非常顯著性差異, 說明造模成功。左、右歸丸組與模型組比較有統(tǒng)計學差異，左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。說明補腎藥左歸丸和右歸丸可以提高去卵巢大鼠的骨密度，見表2。

ELISA測定各組大鼠骨組織中神經肽CGRP、SP、VIP、NPY結果顯示，模型組大鼠神經肽水平明顯下降，與假手術組比較有統(tǒng)計學意義。左歸丸和右歸丸組神經肽水平較模型組顯著上升，與模型組比較有統(tǒng)計學意義。左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。見表3。

表2 各組大鼠骨密度測定結果Table 2 Results of bone mineral density

注：與假手術組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

表3 各組大鼠神經肽測定結果Table 3 Results of neuropeptides in each

注：與假手術組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

去卵巢骨質疏松大鼠骨組織中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經分布明顯減少，左、右歸丸干預后CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神經分布與模型組比較顯著增加。見圖1、2、3、4。

模型組與假手術組比較, 有非常顯著性差異, 說明去卵巢模型大鼠神經肽水平顯著下調。左、右歸丸組與模型組比較有統(tǒng)計學差異，左歸丸與右歸丸組比較無統(tǒng)計學差異。說明補腎藥左歸丸和右歸丸可以上調去卵巢大鼠的神經肽基因表達水平。見表4。

表4 BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY mRNA 的表達Table 4 mRNA expression of CGRP, SP, VIP, and NPY in BMSCs

注：與假手術組比較，▼P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與左歸丸組比較，▽P>0.05

圖1 骨細胞CGRP蛋白 ×200A 假手術組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D右歸丸組陽性表達Fig.1 Expression of CGRP protein,×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖2 SP蛋白表達 ×200A 假手術組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.2 Expression of SP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖3 VIP蛋白表達 ×200A 假手術組弱陽性表達；B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.3 Expression of VIP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

圖4 NPY蛋白表達 ×200A 假手術組弱陽性表達； B 模型組弱陽性表達；C 左歸丸組陽性表達；D 右歸丸組陽性表達Fig.4 Expression of NPY protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group,B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

3 討論

神經系統(tǒng)對骨組織內環(huán)境調節(jié)是多層次、多元和復雜的, CGRP、SP、VIP、NPY作為骨代謝調節(jié)中重要的神經肽及營養(yǎng)因子,在骨吸收和骨形成耦聯(lián)機制中發(fā)揮了極其重要的作用,特別是近年來對神經源性骨質疏松、神經損傷后骨折愈合和異位骨化等深入研究，逐步認識到神經化因素對骨代謝影響的重要性,并提出神經-內分泌-骨的軸線調節(jié)理論[1,2]。骨組織CGRP、SP、VIP、NPY的降低與骨質疏松的形成存在著一定的聯(lián)系。神經肽的減少可能導致其促進骨形成功能的減弱，進一步刺激骨質疏松的形成，這可能是骨質疏松形成的機制之一[3]。

中醫(yī)藥在“腎主骨”理論指導下應用補腎藥物治療骨質疏松癥取得了較好的療效。而隨著中醫(yī)腎本質研究的不斷深入，已經認識到腎虛與衰老具有相同的神經內分泌免疫網絡功能低下的特征, 而補腎藥可以恢復此網絡功能[5]。同時，更具創(chuàng)新性的研究表明腎所藏之精可相應于胚胎干細胞及它分化為各種組織器官的成體干細胞。干細胞具有先天之精的屬性[6]。補腎藥對干細胞神經肽基因表達的的調控更有助于對腎本質的理解。左、右歸丸對腎虛證所取得的療效與其減輕下丘腦-垂體-靶腺的功能損害及修復其功能相關[7]。

基于以上研究成果，本研究選擇左、右歸丸來干預去卵巢骨質疏松大鼠，觀察補腎藥對神經肽網絡以及干細胞中神經肽基因表達的影響，力圖更進一步探索“腎主骨”理論的科學內涵。研究結果表明切除卵巢后大鼠骨組織以及骨髓間充質干細胞中神經肽水平與假手術組比較明顯下降，這表明神經肽的缺乏是骨質疏松癥發(fā)生的原因之一。我們在“腎主骨”理論指導下應用補腎經典名方左、右歸丸干預骨質疏松癥模型，則干預后神經肽水平顯著上升，但仍未達到假手術組的水平，左、右歸丸兩組之間神經肽水平無明顯差異。證明了補腎中藥左、右歸丸可以作用于神經內分泌軸，從而調節(jié)骨代謝。無論滋腎陰還是補腎陽藥物均具有調控神經肽網絡的作用。大量研究也證實補腎藥物可以通過神經-內分泌-免疫(NEI)網絡來調節(jié)骨代謝[8]。至于左歸丸和右歸丸調控神經系統(tǒng)與骨組織間信號傳導的通路有無不同，仍需進一步研究。補腎藥通過提高骨量、調節(jié)骨代謝等環(huán)節(jié)治療骨質疏松癥的療效已得到證實，本研究結果初步證明補腎藥左歸丸、右歸丸可以提高骨質疏松模型大鼠的神經肽水平，但其通過神經肽網絡調控骨代謝的機制仍需深入研究。