硬化蛋白抗體和跑臺運動對老齡去勢大鼠骨重建的影響

繆律 蔣健

上海體育學院，上海 200438

隨著社會老齡化的到來，女性絕經后骨質疏松癥的防治已成為一個迫切的社會問題[1]。中老年女性由于卵巢功能衰減，體內激素水平明顯下降，絕經后女性骨質疏松的發病率明顯高于同年齡段男性。因此，絕經后女性骨質疏松的防治引起臨床醫生和科研人員的關注。

硬化蛋白作為糖蛋白的分泌蛋白，是成骨細胞分化和骨形成的負向調節[2,3]。硬化蛋白是通過結合Wnt信號通路受體相關蛋白LRP5和LRP6，從而可以阻斷Wnt信號通路，減少骨形成[4]。所以硬化蛋白被看作一種抑制骨形成的生理制劑[5]，在臨床治療骨質疏松中頗具優勢。除了藥物治療，運動療法更方便、經濟。體育活動可以增加骨密度和骨強度，當負重運動或其他機械負荷運動達到一定強度時，骨架會對其產生適應性[6]，對骨代謝與重建有明顯的促進作用。硬化蛋白抗體與運動療法之間是否存在協同或反作用，不得而知。所以本研究旨在對去勢大鼠進行硬化蛋白抗體和跑臺運動療法，分析在老齡去勢大鼠骨重建過程中骨代謝指標的影響，證實并闡明骨細胞相關調控機制。

1 材料和方法

1.1 動物分組及處理

8月齡雌性Wistar大鼠60只，購于上海斯萊克動物實驗中心，飼養期間，大鼠自由攝食、飲水，動物房溫度控制在(22.0±1.0)℃，相對濕度(50%±10%)，明暗周期12∶12。飼養1 w后，按體重分層隨機分為以下5組：①Sham組：假手術組(n=12)；②OVX組：去勢組(n=12)；③OVX+E組：在OVX組基礎上實施運動干預組(n=12)；④OVX+S組：OVX組基礎上注射硬化蛋白組(n=12)；⑤OVX+E+S組：在OVX+S組基礎上實施運動干預(n=12)。

實驗干預14 w后，實驗期滿后用10 g/L戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，注射器穿刺右心室取血5.0～6.0 mL，離心處理。血液離心分離后儲存在-80℃超低溫冰箱保持待用。股骨和脛骨解剖游離結締組織及脂肪組織分別儲存在-20℃和-4℃條件下。

1.2 硬化蛋白抗體注射方案

注射硬化蛋白抗體25 mg/(kg·d)，每周2次；假手術組沒有運動干預，注射生理鹽水。

1.3 運動方案

在OVX+E組和OVX+E+S組，每天運動1 h，每周5次，為期14 w。在第1周和第9周，大鼠進行遞增負荷實驗測試最大有氧速度(MAS)。實驗時以5 m/min的速度熱身8 min，之后每2 min增加一個速度級別直至大鼠不能跟上跑臺速度或停止運動，此時的速度即為MAS。簡單來說，1 h的訓練計劃如下：以MAS的50%進行10 min熱身練習。隨后進行5組10 min的跑臺訓練，其中前7 min大鼠以MAS的80%～85%進行鍛煉，后3 min大鼠以MAS的50%進行鍛煉。

1.4 測試指標

1.4.1體重、脂肪量和BMD：體重、脂肪量、瘦體重使用美國GE公司產DPX-MD型雙能X線骨密度儀。用Lunar DPX-MD型骨密標準模型和分析軟件度儀及所附小動物梯級在其腰椎體和右側股骨進行掃描，得出大鼠的BMD。

1.4.2骨組織形態計量學：(1)骨小梁靜態參數：對左股骨遠端干骺端骨骨小梁微結構進行μCT(Skyscan 1072，Skyscan，Belgium)掃描。設置X射線電壓為85 kV，電流110 μA，對骨組織進行掃描，然后利用三維重建軟件進行三維構建。將興趣區截取下來，使用Skyscan μCT分析軟件對下列參數進行測定：骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨量厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。(2)皮質骨參數：對皮質骨的研究，本實驗通過Micro-CT對左股骨遠端干骺端進行二維重建。將皮質骨和骨小梁分離，使用二位計算方法，轉化為二進制圖片。對皮質骨的研究我們采用了和骨小梁相同的采集特性。重建后，利用掃描分析儀軟件繪制骨皮質輪廓。在閾值反轉前，采用簡單的全閾值法，并開發了適用于骨小梁的分析算法，用來表現皮質孔隙度網絡的特性。然后，通過Bouxsein等[7]的算法來計算骨皮質形態參數。總面積、骨髓區和皮層厚度評估使用ImageJ軟件完成。

1.4.3股骨的生物力學性能：通過施加三點彎曲試驗對左側股骨進行力學性能的評估。每個股骨固定在計測儀兩個較低的支架上。調整兩支點間距離為20 mm，將股骨自由放置在支架上，曲面向下，使股骨中點，兩支點中心及加載點重合，以1 mm/min的速度加載至樣本斷裂，用Instron 3343軟件描述載荷-變形曲線。記錄數據：最大負荷(N)、剛度(N/mm)。然后轉化為力-位移曲線，得出以下骨生物力學參數：從最大負荷和橫截面積計算內在的模量(彈性模量，MPa)和最大應力(N/mm2)[8,9]。

1.4.4骨形成和骨吸收的生化分析：14 w實驗后，對骨轉換標記進行分析。骨鈣素測定分析骨形成，骨Ⅰ型膠原氨基端末端交聯肽(NTx)測定分析骨吸收。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定NTx含量。NTx測定使用Ⅰ型膠原ELISA試劑盒。廣商的批內和批間變異系數分別<8%和<10%。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 體重、脂肪量和BMD

表1 實驗后各組大鼠身體體重變化情況一覽表Table 1 Changes of body weight in rats of different groups after the experiment

注：實驗后與實驗前比較，TP<0.05；與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表1可知，在實驗前各組大鼠之間的體重、脂肪量不存在統計學意義。實驗結束后對各組的體重、脂肪量進行測試發現，OVX組的體重、脂肪量要顯著高于Sham組(P<0.05)；OVX+E+S組的體重、脂肪量顯著低于OVX組(P<0.05)；OVX+E組的脂肪量顯著低于OVX組(P<0.05)。各組的瘦體重之間無顯著性差異。

表2 實驗后各組大鼠骨密度變化情況一覽表Table 2 Changes of BMD of rats in different groups after the experiment

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表2可知，OVX組的全身BMD、股骨BMD要顯著低于Sham組，單純性的跑臺療法未引起去勢大鼠BMD的顯著變化；單純性的硬化蛋白抗體療法使得趨勢大鼠全身BMD、股骨BMD顯著增加(P<0.05)；跑臺和硬化蛋白抗體交互作用，能使去勢大鼠的BMD發生顯著提高(P<0.05)。

2.2 骨組織形態計量學

2.2.1骨小梁靜態參數

表3 硬化蛋白抗體和跑臺運動對大鼠股骨遠端骨小梁結構的影響Table 3 Effect of Scl-Ab and treadmill exercise on the trabecular of the distal femur in rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表3可知，OVX組的股骨遠端干骺端的骨小梁體積顯著低于Sham組。單純性的硬化蛋白抗體療法，可以顯著提高去勢大鼠的BV/TV和Tb.Th指標(P<0.05)；單純性的運動療法，能顯著提高去勢大鼠的骨小梁數目(P<0.05)；硬化蛋白抗體和運動交互作用，可以顯著提高趨勢大鼠股骨遠端骨小梁結構參數(P<0.05)。

2.2.2皮質骨參數

表4 硬化蛋白抗體和跑臺運動對去勢大鼠股骨的影響Table 4 Effect of Scl-Ab and treadmill exercise on the femur of female rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表4可知，單純性的硬化蛋白抗體療法能顯著提高去勢大鼠的皮質孔隙率、皮質骨體積和皮質骨厚度；單純性的運動或切除卵巢手術不會引起雌性大鼠上述指標的變化；運動和硬化蛋白抗體交互作用能顯著提高去勢大鼠的皮質骨參數(P<0.05)。

2.3 股骨的生物力學性能

表5 各組大鼠股骨中段生物力學性能評價Table 5 Biomechanical properties of the femur in rats of different

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+S組比較，dP<0.05

由表5可知，OVX組的最大載荷和剛度顯著低于Sham組(P<0.05)；單純性的硬化蛋白抗體治療，可以顯著提高大鼠的最大載荷和剛度指標(P<0.05)；單純性的運動對生物力學性能無顯著影響；運動和硬化蛋白抗體交互作用能顯著提高老齡去勢大鼠的最大載荷和剛度指標(P<0.05)。各組的彈性模量和最大應力之間不存在顯著性差異。

2.4 骨形成和骨吸收的生化分析

表6 硬化蛋白抗體和跑臺運動對去勢大鼠骨轉換標志物的影響Table 6 Effect of Scl-Ab and exercise on bone turnover markers of the femur in female rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+S組比較，dP<0.05

由表6可知，14w后，去勢組大鼠的骨形成標志物OC和骨代謝標志物NTx水平顯著高于Sham組的水平(P<0.05)；單純性的運動療法可以顯著降低去勢大鼠的NTx水平(P<0.05)，對OC水平的影響意義不大；單純性的硬化蛋白療法可以使OC水平升高，但對NTx水平影響不大；硬化蛋白抗體和運動交互作用可以進一步提高去勢大鼠的OC水平(P<0.05)，顯著降低NTx水平(P<0.05)。

3 討論

本實驗對老齡去勢大鼠進行硬化蛋白抗體和跑臺運動干預，探究運動結合藥物在去勢大鼠骨重建過程中，骨代謝指標的影響。

3.1 跑臺運動對去勢大鼠骨重建指標的影響

根據McClung等[10]的研究的運動療法結合硬化蛋白抗體的最佳劑量建議，使用低劑量的硬化蛋白抗體，每次5 mg/kg，每周2次，對老齡去勢大鼠進行為期14 w的實驗。實驗發現切除卵巢使得老齡大鼠的脂肪量增加，導致脂肪百分比上升[11,12]，骨密度顯著下降，這符合實驗預期。單純性的運動能降低去勢大鼠的脂肪量。分析運動持續時間對去勢大鼠的影響，陳曉紅等[13]研究發現持續8 w及8 w以上的中等強度運動跑臺運動可以改善去勢大鼠的骨密度下降；黃誠胤等[14]研究發現12 w的游泳運動能明顯抑制去勢大鼠股骨骨密度的降低；江大雷[15]研究發現12 w的中藥骨疏靈聯合運動能改善去勢大鼠的骨密度；張健等[16]研究發現為期14 w的運動結合雌二醇治療能改善去勢大鼠的骨密度。

目前臨床采用運動療法結合藥物干預，是治療骨質疏松癥的常見手段。本研究中，單純性的運動療法能顯著提高去勢大鼠的骨小梁數目，單純的運動對皮質骨參數無顯著影響。提示只有當運動配合藥物治療時，對骨小梁結構指標會產生較大的影響。本研究還表明：單純性的運動對去勢大鼠的股骨生物力學性能影響效果不大，這一發現與之前劉建宇[17]研究發現運動能改善去卵巢大鼠股骨生物力性能的結論不盡相同。

3.2 硬化蛋白對去勢大鼠骨重建指標的影響

本研究中，去勢大鼠的股骨遠端干骺端的骨小梁體積顯著降低。單純性的硬化蛋白抗體療法，可以顯著提高去勢大鼠的股骨厚度。單純性硬化蛋白抗體療法能提高最大載荷和剛度，說明硬化蛋白可以使骨的應變增強，使得骨結構穩定在一個較高的水平。

研究表明對獼猴[18]、老年雄性大鼠[19]和雌性大鼠[20]使用硬化蛋白抗體，可以提高骨形成、骨密度和骨強度。硬化蛋白抗體還能顯著增強健康男性和絕經后婦女骨形成標志物水平[21]，用于治療絕經后骨質疏松癥的單克隆抗體目前正在進行臨床Ⅲ期實驗。金麗等[22]研究發現游泳加中藥淫羊藿綜合療法能促進骨形成、抑制骨吸收，防治去卵巢大鼠發生骨質疏松。

本研究發現：單純性的運動療法能使NTx下降而不影響OC水平，單純性的硬化蛋白抗體療法可以使OC水平顯著升高而NTx水平保持不變。提示去勢大鼠骨量丟失與骨轉換標志物OC和骨代謝標志物NTx的變化不同步。

3.3 硬化蛋白和跑臺運動交互作用對去勢大鼠骨重建指標的影響

本研究發現，運動和硬化蛋白抗體交互作用時，不僅降低了去勢大鼠的脂肪量，還顯著提高了BMD，說明硬化蛋白抗體結合運動能改善老齡去勢大鼠的骨密度。硬化蛋白和跑臺運動協同作用對去勢大鼠骨小梁靜態參數有促進作用。分析藥物結合運動的治療方案，有助于解釋不同藥物結合運動對皮質骨的影響差異。孫曉雷等[23]研究發現柚皮苷聯合運動能有效治療去勢大鼠股骨遠端骨小梁結構。覃飛等[24]研究發現低強度激光和有氧運動能增加絕經期大鼠骨小梁數目。本研究中運動和低劑量的硬化蛋白交互作用時，才能發揮顯著地促進作用，進一步為硬化蛋白抗體與運動之間的協同作用提供了間接佐證。

當運動和硬化蛋白交互作用時，對股骨生物力學性能起到了促進作用，分析原因：一方面是硬化蛋白的間接作用，另一方面可能是運動降低非酶糖化的骨基質，這與骨的延展性有一定聯系，可能是OVX+E+S組大鼠骨膜輕微擴張的結果。也有研究表明通過數月的運動，可以降低大鼠非酶交聯骨基質[25]。考慮到本實驗對象為老齡大鼠，強度與Kohrt建議的運動處方一致，所以認為本實驗采用的藥物聯合運動防止骨質疏松癥方法可以應用于中老年人，建議該人群采用步行、劃船、持舉啞鈴等運動方式、50%～60%VO2max的運動強度進行運動。當運動配合藥物治療，表現出良好的協同作用，可以提高OC水平的同時減低NTx水平。

4 結論

適度的跑臺運動可以防止老齡去勢大鼠骨丟失，改善去勢大鼠骨健康。硬化蛋白抗體療法可以增加皮質骨骨量和骨強度，預防去勢大鼠絕經后對骨代謝產生的不良影響。硬化蛋白和運動表現出良好的協同作用，對老齡去勢大鼠骨重建具有積極的作用。