SOST和β-catenin在不同分期膝骨關節炎患者軟骨及軟骨下骨表達的研究

吳疆 吳龍 馬龍 金群華

寧夏醫科大學總醫院骨三科，銀川 750004

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是機械性和生物性因素相互作用，使關節軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨合成與降解的正常進行失去平衡的結果。膝骨關節炎的病因較為復雜，盡管年齡因素與OA強烈相關，但是其他因素仍然會導致OA的發生[1,2]。骨關節炎最主要的特征是關節軟骨的漸進性破壞，軟骨下骨變厚和邊緣骨贅形成，并且這種破壞在整個關節的軟組織中均有發生[3]。

在OA中，關節軟骨的丟失可能與軟骨下骨有關。軟骨下骨和軟骨解剖位置緊密相鄰，位于關節軟骨下方，包括皮質終板及其下方的骨小梁結構，與軟骨共同維持關節形態，承受應力，而且軟骨下骨可以通過生物學信息交流，對軟骨，尤其是軟骨深部組織的營養起著重要作用[4]。下肢負重力線隨著OA疾病發展的改變直接或間接的影響了這兩部分鄰近組織間細胞信號的傳遞，從而可能會對軟骨及軟骨下骨產生破壞作用，加速疾病的發展[5]。

Wnt-β-catenin信號通路最初是在胚胎的形成及發育中被廣泛認知的，在維持骨與軟骨穩定性方面起到重要作用[6]。已有大量實驗證明了Wnt信號通路在人類成骨中起到重要作用，并且β-catenin升高使成骨增加。而在人類軟骨中，激活的Wnt-β-catenin信號通路會破壞軟骨組織，加速OA疾病發展[7]。骨硬化蛋白, 又稱SOST，由骨細胞和肥大的軟骨細胞表達[8]，可以抑制骨形態蛋白(BMP)分泌的同時可以通過結合LRP5/6受體抑制Wnt信號通路[9]。因此，明確在OA疾病的發展過程中，β-catenin和SOST在骨關節炎患者軟骨及軟骨下骨中所可能產生的變化，對于探究OA疾病的發生發展以及治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 人膝關節標本的獲取

OA標本和正常標本均取自2013年10月至2015年10月就診于寧夏醫科大學總醫院骨三科的患者所捐贈的內側脛骨平臺組織，經過了寧夏醫科大學倫理委員會的批準(倫理編號：2015-005)。OA膝關節標本(OA組，39例，其中女性29名,男性10名,平均年齡為 61.6±6.8歲)。取自骨關節炎并內翻屈曲畸形患者的新鮮內側脛骨平臺組織，診斷標準采用美國風濕學會制定的骨關節炎診斷標準[10]。排除因創傷、類風濕等繼發性膝關節骨關節炎。正常的膝關節標本(正常組，6例，其中2名女性，4名男性,平均年齡 24.7±5.9歲)。均取自因下肢毀損傷行截肢術患者的新鮮內側脛骨平臺組織，排除因糖尿病、腫瘤等原因行截肢術的患者。將術中截取的新鮮脛骨平臺立即置于超凈工作臺，在內側脛骨平臺的中央負重區用咬骨鉗取2.0×2.0×1.0 cm3大小的組織塊，保留軟骨及軟骨下骨。置入10%中性福爾馬林浸泡24 h，沖洗后常溫下置于10%EDTA液中脫鈣，每4d更換脫鈣液，脫鈣8 w。常規石蠟包埋后做4 μm連續縱行切片。

1.2 番紅O-固綠染色及改良Mankin評分

將0.5 g番紅O溶于95%乙醇100 mL制成0.5%番紅O乙醇溶液。染液滴染2 min，鏡下觀察染色情況后蒸餾水沖洗掉染液，95%乙醇分化數秒，風干，二甲苯透明，中性樹膠封固。置于顯微鏡下觀察，后采用改良Mankin評分(見表1)將標本分為正常組(0～3分)，中度OA組(7～9分)和重度OA組(10～12分)。

表1 關節軟骨的改良Mankin評分標準Table 1 Modified Mankin score of the joint cartilage

1.3 免疫組化染色

石蠟切片經烤片、水化、抗原修復、消除內源性過氧化物酶之后，用兔源抗SOST抗體，兔源抗β-catenin抗體在37℃下孵育90 min，兩步法孵育二抗后，DAB顯色數秒，鹽酸酒精分化，自來水沖洗反籃，梯度脫水。將切片置于顯微鏡下觀察顯色情況。每張切片在10倍光鏡下在軟骨區域分別隨機選取3個視野，以軟骨及骨細胞質及細胞核著黃褐色為β-catenin陽性細胞，以軟骨細胞、骨細胞及周圍的骨陷窩著黃褐色為SOST陽性骨細胞，分別計數軟骨下骨板及其下骨小梁區域β-catenin、SOST陽性骨細胞個數，以陽性細胞率(染色陽性的骨細胞個數/總的骨細胞個數×100%)表示蛋白的表達量。

1.4 統計學處理

應用SPSS20.0統計軟件，采用SNK-q檢驗比較正常組、OA中期組、OA晚期組這3組軟骨及軟骨下骨中SOST和β-catenin的陽性細胞數是否存在組間差異。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 39例OA患者和6例截肢患者的內側脛骨平臺組織改良Mankin評分結果

6例截肢患者均分到正常組，改良Mankin評分為(1.3±1.2)分，番紅O-固綠染色鏡下表現為：軟骨表層完整，軟骨細胞各層排列整齊，軟骨基質紅染。14例中度OA組，評分為(7.7±0.9)分，鏡下表現為軟骨裂隙進入輻射層或深達鈣化層，裂隙周圍軟骨細胞增殖、簇集，軟骨基質淡染，局部軟骨下骨暴露，軟骨下骨板及骨小梁厚度增加。25例重度OA組，評分為(13.0±1.2)分，軟骨層纖維化嚴重或大面積缺失，軟骨基質重度失染，廣泛軟骨下骨暴露、象牙化，軟骨下骨板及厚度明顯增加(圖1)。

圖1 內側脛骨平臺標本的番紅O-固綠染色，標尺：500 μmFig.1 Safranin O staining of the medial tibial plateau, Bar, 500 μm

2.2 SOST免疫組化染色在內側脛骨平臺軟骨及軟骨下骨的表達情況

正常組的樣本在軟骨表層中幾乎沒有SOST染色陽性的軟骨細胞，在深層鄰近鈣化軟骨區域可見少量陽性細胞，SOST染色陽性細胞百分比為11%。在中度OA組中，軟骨表層及深層均可見大量的陽性細胞，SOST染色陽性細胞百分比為59%。而在重度OA組中，軟骨中陽性細胞數量明顯減少，在軟骨表層也幾乎沒有陽性細胞存在，SOST染色陽性細胞百分比為12%。統計陽性細胞百分比后進行統計學分析，發現在中度OA組中SOST染色陽性細胞百分比高于正常組和重度OA組(P<0.05)，而正常組和重度OA組兩組間沒有差異 (P>0.05)(圖2，6a)。在正常組軟骨下骨中可見大量SOST染色陽性軟骨細胞，SOST染色陽性細胞百分比為58%，中度OA組中可見鈣化軟骨區域及軟骨下骨區域有SOST染色陽性細胞，SOST染色陽性細胞百分比為38%，在重度OA組的軟骨下骨中可減少量染色陽性的SOST骨細胞，其染色陽性百分比為16%。統計學分析后發現SOST染色陽性細胞數在正常組軟骨下骨組織中最高，中度OA組和重度OA組中均有所減少，且重度OA組少于中度OA組(P<0.05)(圖3,6b)。

圖2 各組軟骨中軟骨細胞SOST染色陽性情況，標尺：200 μmFig.2 Immunostaining of SOST in joint cartilage of different groups, Bar, 200 μm

圖3 各組軟骨下骨中骨細胞SOST染色陽性情況，標尺：200 μmFig.3 Immunostaining of SOST in subchondral bone of different groups, Bar, 200 μm

2.3 β-catenin免疫組化在內側脛骨平臺軟骨及軟骨下骨的表達情況

在正常組的軟骨中β-catenin染色陽性細胞數量很少，β-catenin染色陽性細胞百分比為17%。在中度OA組可以發現染色陽性細胞多數聚集在軟骨表層，β-catenin染色陽性細胞百分比為49%，數量明顯多于正常組(P<0.05)。但是與中度OA組中SOST染色相比，β-catenin陽性細胞多聚集在軟骨表面而SOST陽性細胞多聚集在鈣化層及深層軟骨區域，這可能與Wnt/β-catenin信號通路對機械應力的感應以及軟骨-軟骨下骨相互作用有關。在重度OA組中可以發現β-catenin染色陽性細胞已經不僅僅局限于軟骨表層，在軟骨深層也可見大量染色陽性細胞，β-catenin染色陽性細胞百分比為62%，數量明顯多于中度OA組(P<0.05)(圖4，圖6c)。在正常組的軟骨下骨中可見少量的β-catenin染色陽性細胞，陽性細胞百分比為42%，中度OA組中陽性細胞(58%)明顯高于正常組(P<0.05)，重度OA組中陽性細胞(74%)明顯高于中度OA組(P<0.05)，表明β-catenin在軟骨下骨中的表達量隨著OA疾病的發展而逐步增高(圖5，圖6d)。

圖4 各組軟骨中軟骨細胞β-catenin染色陽性情況，標尺：200 μmFig.4 Immunostaining of β-catenin in joint cartilage of different groups, Bar, 200 μm

圖5 各組軟骨下骨中骨細胞β-catenin染色陽性情況，標尺200 μmFig.5 Immunostaining of β-catenin in subchondral bone of different groups, Bar, 200 μm

圖6 免疫組化染色陽性細胞百分比與正常組比較，*P<0.05；與中度OA組比較，#P<0.05Fig.6 Percentage of positive staining cells*P<0.05, versus control group;#P<0.05, versus mid-stage OA group

3 討論

OA疾病的發生與發展與很多因素相關，目前，Wnt信號通路在OA中的作用仍在探索， SOST對OA關節軟骨是否有保護作用尚存在爭論。Wnt/β-catenin信號通路的激活，在骨組織中表現為促進成骨，而在軟骨中表現為加速軟骨的分解。SOST作為Wnt-β-catenin的膜受體拮抗劑，可以抑制Wnt-β-catenin信號通路，從而對軟骨產生保護作用。Chan等[11]證明了在軟骨中，升高的SOST可以通過抑制Wnt-β-catenin信號通路控制下游分解酶，MMP-13，ADAMTS-4，5的表達，從而對軟骨產生保護作用。SOST單克隆抗體可以拮抗SOST對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用，從而促進成骨，治療骨質疏松[12]。因此探究SOST隨著OA疾病的發展在軟骨及軟骨下骨中所起到的作用及其作用機制就顯得尤為重要。

我們發現在OA疾病過程中，SOST在軟骨中和軟骨下骨中的變化是不一致的。它們在軟骨中的表達隨著OA疾病的發展表現為先增多后減少，這與Bouaziz等[13]在OA造模小鼠軟骨中的報告相一致。而β-catenin卻持續增加，表明Wnt/β-catenin信號通路的表達隨著疾病的發展而不斷升高，其下游的分解代謝酶，如MMPs和ADAMTSs的表達量也會持續升高，造成軟骨細胞凋亡，軟骨基質破壞。SOST在軟骨中的表達量升高后理論上會抑制Wnt信號通路從而減少β-catenin，然而在軟骨中我們并沒有發現這一現象。而在軟骨下骨中，SOST的表達量持續減少，與之相對應的，β-catenin的表達量也與軟骨中一樣持續升高，不斷的刺激成骨，造成軟骨下骨硬化及骨贅形成。然而我們并不能證明在軟骨及軟骨下骨中觀察到的Wnt信號通路活動的變化與SOST變化相關。Wnt信號通路在OA疾病的過程中所起到的作用是極其復雜的，我們即使通過用SOST在軟骨中抑制了信號通路的激活，但是在體內，它們也不可避免的會作用到軟骨下骨及骨，抑制骨形成，在OA疾病的發展過程中造成更多地微骨折，使軟骨下骨喪失緩沖機械應力的作用，這同樣也會加速疾病的發展。

OA病變包括了關節內所有的結構，最終導致關節軟骨的降解這一觀點已達成共識。軟骨下骨是關節的重要組成部分，其主要生物力學效應是吸收應力、緩沖震蕩和維持關節形狀。其彈性模量較關節軟骨低，但其數量較多，在緩沖震蕩中起主要的襯墊作用，避免關節軟骨受過度應力損傷[14]。在軟骨中，Wnt/β-catenin信號通路過度激活被認為是起到破壞軟骨的作用，而骨硬化蛋白同樣亦可以抑制Wnt-β-catenin信號通路保護軟骨。我們發現在軟骨中SOST隨著疾病的發展表現為先升高后降低，SOST作為Wnt-β-catenin信號通路的抑制劑，在軟骨中SOST表達量升高后，β-catenin應該下降，而后SOST表達量下降后，β-catenin理應升高。然而在實驗中我們并沒有觀察到這一現象，β-catenin表達持續升高，并沒有受到SOST的影響。因此我們推測，不能單純的認為軟骨中的SOST完全由軟骨細胞分泌，而軟骨下骨中的SOST完全由骨細胞分泌的。軟骨和軟骨下骨之間會有大量的物質交換，那么SOST是否也會通過軟骨-軟骨下骨連接處，從而在對兩個部分的細胞產生不一樣的作用呢？在軟骨中SOST的升高是否會激活或者抑制其它信號通路，與Wnt-β-catenin信號通路產生協同或者拮抗作用，從而掩蓋了SOST對Wnt-β-catenin信號通路的抑制作用，從而解釋我們觀察到的β-catenin與SOST隨著OA疾病發展而產生的變化。同樣，軟骨下骨受應力刺激，激活Wnt/β-catenin信號通路促進成骨。SOST分泌增多抑制Wnt-β-catenin信號通路，減少了β-catenin的表達，延緩軟骨下骨硬化，從而可以維持軟骨下骨的正常結構，使其發揮正常功能。然而考慮到軟骨中SOST與β-catenin的反常變化，軟骨下骨中這兩種因子是否只是單純的通過Wnt-β-catenin信號通路產生相互作用，仍然未知。我們的實驗僅僅是觀察到了SOST和β-catenin這個OA疾病發展過程中的關鍵因子在軟骨、軟骨下骨中表達的變化情況，而探究SOST以及Wnt-β-catenin信號通路兩者在OA疾病發展中的作用機制，可能會為骨關節炎疾病的發生發展及治療提供新的思路。