補腎強督方對強直性脊柱炎膜內成骨Wnt/β-catenin通路影響的實驗研究

徐愿 孔維萍 陶慶文 楊文雪 金玥 閻小萍

中日友好醫院中醫風濕病科，免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性炎性疾病，主要侵犯骶髂關節、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關節，并可伴發關節外表現[1]。多數AS患者在疾病后期繼發韌帶、纖維環、關節軟骨、關節囊的病理性成骨，使脊柱逐漸失去柔軟度，造成脊柱強直和關節畸形。在AS中表現為附著點和滑膜關節、軟骨結合處形成新骨[2]。這種結構損傷很難逆轉，往往導致AS患者脊柱活動受限及關節功能降低，輕者出現下蹲、彎腰、轉頭等受限，重者行動困難，晚期出現關節屈曲攣縮、畸形或強直，嚴重影響患者的關節功能和生活質量，給家庭和社會造成沉重的負擔[3]。目前普遍認為，AS的病理性成骨主要通過兩種方式：軟骨內成骨和膜內成骨。①軟骨內成骨的過程為骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過聚集和分化形成軟骨細胞，經過增生、成熟、分化和凋亡，最后形成骨組織。研究表明軟骨內成骨是AS骨贅生成的主要形式[4]。②膜內成骨則是BMSCs直接分化為成骨細胞。膜內成骨可能與AS脊柱縱韌帶鈣化有關[4]。Wnt/β-catenin通路是調節這兩種成骨過程的最重要的分子機制，本研究觀察補腎強督方對BMSCs 的Wnt/β-catenin通路的作用，為中醫治療AS提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞分化培養

人BMSCs(購自Sciencell，貨號：7500)分為空白對照組、西藥對照組、補腎強督方低、中、高劑量組。各組細胞分別于MSCM (含 100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素、5%胎牛血清)中進行培養。將人骨髓間充質干細胞分別按照1×105/孔的密度接種于100 mm平皿中，每皿加入不同組全培養基6 mL；按1萬/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入不同組全培養基2 mL；按1千/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入不同組全培養基200 μL。將各培養皿和培養板置于37℃，5% CO2的培養箱中培養3 d，使細胞貼壁，擴增至90%左右，吸棄各培養皿和培養板中的培養基，換為MDOM(間充質干細胞成骨分化培養基) ( 含大鼠含藥血清 20%)，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養21 d。

1.2 藥物補腎強督方

組成：熟地20 g，金狗脊30 g，鹿角6 g，骨碎補15 g，補骨脂10 g，桂枝12 g，赤芍12 g，白芍12 g，知母15 g，秦艽15 g，羌活12 g等。中日友好醫院藥劑室煎制，藥物水煎、過濾、濃縮至含生藥2.5×103g/L。以洛索洛芬鈉為對照藥物(上海三共制藥有限公司，國藥批字：H20030769)。

1.3 大鼠含藥血清制備

實驗動物選用Wistar雄性大鼠進行灌胃給藥，連續給藥7 d，末次給藥兩次，間隔1 h，末次給藥前12 h，禁食不禁水，末次給藥后1 h大鼠稱重，平均220 g/只，10%水合氯醛(中日醫院提供)麻醉，每只1.2 mL，剖腹，腹主動脈取血，離心，吸取血清，-20℃保存。藥物以補腎強督方為治療藥物，以洛索洛芬鈉為對照藥物，分組為空白對照組、西藥對照組(予洛索洛芬鈉3 mg/(kg·d)、補腎強督方低、中、高劑量組[分別予補腎強督方0.9、1.8、3.6 g/(kg·d)]。使用前滅活(56℃,30 min)，過濾(0.22 μm)。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1試劑及儀器：MSCM(間充質干細胞培養基)、MODM(間充質干細胞成骨分化培養基)、胎牛血清、MTT試劑盒( Sciencell，美國)；茜素紅S染色試劑盒(Ared，美國)；Elisa試劑盒( R&D，美國)；RIPA裂解液(凱基生物，中國)；Trizol(Invitrogen，美國)；cDNA轉錄試劑盒(Roche，瑞士)；引物合成(Invitrogen，美國)；Power SYBR Green PCR Master Mix(Biosystems，美國)。細胞培養箱(Thermo Scientific，美國)；超凈臺(Airtech，美國)；臺式大容量高速離心機(Eppendorf，德國)；超微量高精度紫外分光光度計 ( ND-1000，美國)；多功能酶標儀SpectraMax M2(Molecular Devices，美國)；DNA Engine Dyad PCR 儀(Bio-Rad，美國)；7500熒光定量PCR儀(Biosystems，美國)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.4.2ELISA方法檢測ALP、BGP蛋白含量：BMSCs培養21d后取細胞培養上清液，按照ALP、BGP的ELISA試劑盒說明書操作，450 nm光波處測吸光值，540 mm光波處校正。

1.4.3免疫印跡法分析BMSCs中DKK-1、β-catenin蛋白含量：BMSCs誘導分化21 d后用RIPA法提取蛋白質，BCA法測定蛋白濃度，蛋白質免疫印跡(Western blot，WB)檢測細胞中的目標蛋白質含量。樣品加入上樣緩沖液后100℃加熱3 min。每孔上樣20 μL總蛋白進行SDS-PAGE。電泳后半干轉蛋白至裁剪好的電轉膜上，所用濾紙(Whatman,3MM CHR)，電轉完畢后，將電轉膜置于5%的脫脂奶粉封閉，37℃2 h，加一抗β-catenin(Abcam,貨號：ab32572，兔單克隆抗體IgG)和DKK1(Abcam,貨號：ab109416，兔單克隆抗體IgG)，均為1∶1000稀釋。4℃孵育過夜后加二抗(KPL，貨號：074-1516)，室溫孵育2 h，ECL發光試劑盒顯影，以β-actin為內對照，拍照，對雜交帶進行密度掃描分析，比較蛋白的相對表達。

1.4.4熒光定量PCR測定BMSCs膜內成骨中DKK-1mRNA和β-cateninmRNA表達：Trizol提取成骨細胞總RNA。取1μg總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再取1 μg cDNA 行熒光定量PCR反應。DKK1 mRNA上游引物為：5′- TCACACCAAAGGAC AAGAAG-3′，下游：5′-ATCTTGGACCAGAAGTGT CTAGC-3′，β-catenin mRNA上游引物為：5′-ACAAACTGTTTTGAAAATCCA-3′，下游：5′-CGAGT CATTGCATACTGTCC-3′。引物均由Invitrogen公司合成，以cDNA為模板按Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書配制20 μL的PCR反應體系，按以下條件進行擴增：步驟1，預變性，1 cycle，95℃，2 min；步驟2，熱循環，40 cycle，95℃，15 s，60℃，1 min；步驟3，溶解曲線。每種樣品做3個復孔，計算時取平均值。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 各組BMSCs成骨分化ALP、BGP的比較(見表1)

圖1 補腎強督方對BMSCs成骨分化中DKK-1及β-catenin蛋白量的影響Fig.1 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the protein levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiationWestern blot檢測BMSCs成骨分化中產生DKK-1及β-catenin相對蛋白濃度，以均數±標準差表示。A: DKK-1 Western blot 電泳圖；B：DKK-1 蛋白表達結果分析直方圖 Western blot 電泳圖；D：β-catenin蛋白表達結果分析直方圖與空白對照組比較，*P<0.05，** P<0.01，與西藥對照組比較，△P<0.05，與中藥低劑量組比較，#P<0.05

各組細胞上清液ALP及BGP采用ELISA檢測，結果顯示，各組間比較無統計學差異(P>0.05)。

2.2 各組BMSCs成骨分化中DKK1、β-catenin蛋白比較(見圖1)

各組細胞DKK1采用Western blot檢測，結果顯示：與空白對照組比較，中藥高劑量DKK1蛋白質產生量顯著增高(P<0.01)，與中藥低劑量組及西藥對照組比較，中藥高劑量DKK1蛋白質產生量顯著增高(P<0.05)。其他各組件比較無差異(P>0.05)。

表1 各組BMSCs成骨分化后ALP、BGP比較Table 1 Comparison of ALP and BGP between each BMSCs group after osteoblast

各組細胞β-catenin采用Western blot檢測，結果顯示：與空白對照組及西藥對照組比較，中藥高劑量β-catenin蛋白質產生量顯著降低(P<0.05)；其他各組件比較無差異(P>0.05)。

2.3 各組BMSCs成骨分化DKK1 mRNA及β-catenin mRNA表達的比較(見圖2)

各組細胞DKK1 mRNA表達結果顯示：與空白對照組比較，中藥高中低劑量組DKK1 mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；與西藥對照組比較，中藥中高劑量組DKK1 mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；與中藥中低劑量組比較，中藥高劑量組DKK1 mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；其他各組件比較無差異(P>0.05)。

圖2 補腎強督方對BMSCs成骨分化中DKK-1mRNA及β-cateninmRNA表達的影響Fig.2 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the mRNA levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiation熒光定量PCR檢測BMSCs成骨分化中產生DKK-1 mRNA及β-cateninmRNA 表達，以均數±標準差表示。A:DKK-1 mRNA表達結果分析直方圖表達結果分析直方圖與空白對照組比較，*P<0.05；與西藥對照組比較，△P<0.05；與中藥低劑量比較，#P<0.05；與中藥中劑量比較，P<0.05

各組細胞β-catenin mRNA表達結果顯示：與空白對照組比較，中藥高中低劑量組β-catenin mRNA達水平顯著降低(P<0.05)；與西藥對照組比較，中藥高中劑量組β-catenin mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高中劑量組β-catenin mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組β-catenin mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；其他各組件比較無差異(P>0.05)。

3 討論

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)在疾病進展過程中可同時存在骨丟失和骨形成兩個看似矛盾的結果。AS骨丟失表現為骨質破壞及骨質疏松，本病基本都累及骶髂關節，表現為侵蝕性改變；24%～36%患者出現髖關節骨破壞，嚴重者導致髖關節強直、甚至致殘[5]；19%～62%患者出現骨質疏松，甚至在疾病早期即可出現，顯著增高脊柱骨折、特別是脊柱壓縮骨折的風險[6]。AS骨形成，亦即病理性成骨，多發生在附著點部位，特別是脊柱部位多發，22%～24%患者出現較明顯骨化進展，50%～60%無明顯骨化進展[7,8]，骨化導致的脊柱強直在病程后期是導致患者痛苦的主要原因，明顯影響脊柱活動度，部分長病程患者甚至因功能障礙而致殘[9,10]。

骨化研究是AS目前研究的熱點，但是進展緩慢，其原因有二：其一，骨化往往發生脊柱附著點部位，病理組織非常難以獲取，病理學研究大部分是20世紀基于尸體解剖獲得[11]，而現代影像技術如MRI能很好發現炎癥改變，但對骨化病變不敏感；其二，骨化進程非常緩慢，且個體間差異大，研究周期往往需要5～10年[7,8]，甚至更長，給研究造成了很大困難。在AS骨化發生機制方面，目前研究證實Wnt、BMP和Hedgehog信號通路與骨化有關，而Wnt通路是研究最為清晰的通路。最早研究Wnt通路在骨化中的作用是一個巧合，為了研究Wnt通路在炎性關節病相關骨質疏松的作用，采用阻斷TNF-α轉基因鼠中Wnt通路阻滯劑DKK-1，發現實驗動物大量發生骨化[12,13]，從而發現Wnt通路在骨化中的作用。進一步研究逐漸發現，發生韌帶骨贅的AS患者血清中Wnt通路抑制因子DKK1和SOST水平顯著降低[12,14,15]，目前已經提出用DKK1作為骨化的生物標記物[14]。細胞學研究表明，Wnt通路激活可促進BMSCs的軟骨內成骨和膜內成骨，導致骨化發生[16]，Wnt通路激動劑Wnt5a還能促進BMSCs表達非組織特異性堿性磷酸酶，促進其骨化進展[17]。AS患者Wnt通路的異常激活參與了AS骨化的發病，因此，從Wnt通路研究中醫改善AS骨化的可能機制具有必要性。

閻小萍教授提出強直性脊柱炎“腎虛督寒”的中醫基本病機[18]。腎藏精，主骨生髓，腎氣虧虛，感受外邪，骨失淖澤而出現骨損、骨痿，表現為關節破壞以及骨質疏松；督脈行于脊背，通于腎，總督人身諸陽，寒邪侵襲，督脈受邪則陽氣開闔不得，寒凝督脈而致筋脈攣急，出現脊背僵硬、僵曲不得伸，表現為脊柱骨化、甚至強直改變。“腎虛督寒”的病機很好地解釋了本病骨丟失和骨形成兩個相矛盾的表現。基于此，創立了“補腎強督方”，該方由熟地、金狗脊、鹿角、骨碎補、補骨脂、桂枝、赤芍、白芍、知母、秦艽、羌活等組成，諸藥共湊補腎祛寒、壯督除濕、活血通脈、強健筋骨之效。補腎強督方治療AS的療效已得到諸多研究驗證：①緩解炎癥，改善癥狀，治療3月中醫有效率達94.5%[19]，達到ASAS20者占74.3%[20]；②改善骨質疏松，顯著提高患者骨密度，調節骨代謝[21]，基于補腎強督方研制的補腎舒脊顆粒改善髖關節功能，延緩髖關節X線進展[22]；③調節骨化相關細胞因子，上調血清中骨化抑制因子DKK-1的水平[23]。通過驗證研究，進一步證實了AS“腎虛督寒”基本病機。

本研究是對系列研究的進一步補充，結果提示，補腎強督方能夠抑制BMSCs成骨分化中Wnt通路的激活，上調DKK-1水平，而臨床研究亦提示該方能上調AS患者血清中DKK-1水平，這些均提示該方可能通過Wnt通路抑制AS骨化過程中BMSCs的膜內成骨過程起到調節作用。BMSCs成骨分化是維持骨量的機制之一，雖然該方對Wnt通路有抑制作用，但是不會導致AS骨丟失，因為該研究還顯示，補腎強督方在BMSCs成骨分化作用中，體現成骨能力的ALP和BGP無差異，而且該方能夠調節成骨細胞OPG/RANKL系統，促進骨生成，抑制骨吸收，改善骨質疏松癥[24]。因此，基于“腎虛督寒”理論創立的補腎強督方對AS具有抑制骨化，同時抑制骨丟失的雙向作用。對該病機的進一步研究，對于尋找治療AS骨化的有效藥物具有一定的提示作用。