潰瘍性結腸炎模型鼠中調節性T細胞亞群變化的研究

馬亞會， 張 杰， 邵淑琳， 肖魯瑤， 劉心娟

1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院消化內科，北京 100029； 2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院消化內科

潰瘍性結腸炎模型鼠中調節性T細胞亞群變化的研究

馬亞會1， 張 杰1， 邵淑琳1， 肖魯瑤1， 劉心娟2

1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院消化內科，北京 100029； 2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院消化內科

目的 探討潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)模型鼠不同組織中調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)亞群的變化。方法 通過飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium，DSS)溶液誘導UC模型鼠，應用流式技術測定實驗鼠外周血、腸系膜淋巴結、脾臟、回腸固有層、結腸固有層黏膜中Treg細胞亞群、CD4+CD25+FoxP3+IL-17+數量；分選上述組織單個核細胞中Treg細胞中的FrⅢ亞群，檢測FoxP3、IL-17、RORC mRNA表達水平。結果 在UC模型鼠的脾臟、腸系膜淋巴結、回腸固有層、結腸固有層黏膜中，Treg細胞FrⅠ亞群水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)。在外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層、結腸固有層中，UC模型鼠中Treg細胞中FrⅡ亞群水平均顯著低于正常對照組(P<0.05)，而Treg細胞FrⅢ亞群水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)。在UC模型鼠的外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層、結腸固有層中，Treg細胞FrⅢ亞群相關基因表達如下：FoxP3 mRNA表達水平低于正常對照組(P<0.05)；IL-17A、RORC mRNA表達水平高于正常對照組(P<0.05)。在UC模型鼠的外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層、結腸固有層中，CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細胞水平高于正常對照組(P<0.05)。結論 UC模型鼠中存在FrⅡ亞群減少、FrⅢ亞群增多和FrⅠ亞群轉化障礙，Treg細胞亞群間的這種變化可能是Treg細胞和Th17細胞失衡的內在原因。

潰瘍性結腸炎；Th17細胞；調節性T細胞亞群

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)發病可能與腸道黏膜屏障功能缺陷、異常免疫反應、感染、遺傳和腸道微生態失調等有關，其中在免疫反應方面CD4+T細胞在UC中起重要作用[1-2]。文獻報道[3]在UC患者腸管黏膜中Treg細胞功能受損伴Th17細胞數量增多，證實UC中Treg細胞和Th17細胞免疫失衡，這種異常免疫可能參與了UC的發病。

Treg細胞依據功能不同可分為3種亞群[4-5]，分別是CD45RA+Foxp3lowresting Treg細胞(rTreg，FrⅠ)、CD45RA-Foxp3highactived Treg細胞(aTreg，FrⅡ)和CD45RA-Foxp3low非抑制性T細胞(FrⅢ)；其中FrⅡ是主要發揮免疫抑制功能的一群細胞；FrⅡ型細胞的減少嚴重影響Treg細胞功能；FrⅠ是一群靜息狀態的Treg細胞；FrⅢ細胞則是沒有抑制功能的細胞，但可以分泌IL-17，存在轉化為Th17細胞的潛能。在自身免疫病中存在著Treg亞群的異常[6]。本研究通過對Treg細胞亞群的研究，進一步剖析Treg/Th17 細胞失衡的內在原因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選用C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，6～8周齡，18～20 g，均為雄性，共10只，為SPF級。每日標準飼養、自由飲水及日常光照。

1.2 試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MP Biomedical)，CD4-PerCP(BD PharmingenTM)，CD25-APC(BD PharmingenTM)，CD45RA-PE(BD PharmingenTM)，IL-17-Alexa Fluor?488(BD PharmingenTM)，FoxP3-PE-Cyanine7(eBioscience)，CD3e-PE-CF594(BD HorizonTM)，CD8a-BV510(BD HorizonTM)，fixation and permeabilization(eBioscience)，RNeasy Micro Kit(Qiagen)FastQuant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN)，SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(TIANGEN)；GAPDH Primer(PMM04，Shenggong)，FoxP3，IL-17 RORC mRNA引物(上海生工生物技術有限公司設計并合成)。引物序列見表1。

表1 小鼠Real-time PCR引物序列

Tab 1 The sequences of primers for Real-time PCR in mice

PrimersForward(5'-3') Reverse(5'-3') FoxP3mRNA CTGCCTTGGTACATTCGTGACAGATGTTGTGGGTGAGTGCIL-17mRNA CTGTGTCAATGCGGAGGGAACGACCCTGAAAGTGAAGGGGRORCmRNA ACGGCCAACTTACTCTTGGAAGAAACTGGGAATGCAGTGG

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：C57BL/6雄性小鼠隨機分成正常對照組和潰瘍性結腸炎模型組(UC模型組)，每組小鼠各5只。正常對照組飲用蒸餾水14 d，UC組口服2.5% DSS溶液7 d，繼之改飲蒸餾水7 d；造模為期14 d，14 d后脫頸處死小鼠并取材進行檢測。按照Murthy評分系統[7](見表2)評估小鼠UC活動度指數(disease activity index，DAI)，結腸組織病理學表現評估UC結腸的炎癥，證實造模成功。

表2 小鼠結腸炎疾病活動指數評估(DAI)

Tab 2 The assessment of disease activity index (DAI) in UC mice

分數體質量減輕率(%)糞便黏稠度隱形/肉眼血便0(-)正常(顆粒狀、成形)正常11～5 ——26～10松軟(糊狀不黏附肛門)潛血陽性311～15 ——4>15腹瀉(水樣、黏附肛門)血便

注：DAI=(體質量減輕率+大便黏稠度+隱形/肉眼血便的總分數)/3。

1.3.2 Treg細胞亞群水平檢測：提取小鼠外周血、脾臟、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜單個核細胞，在24孔培養皿中加入2 μl白細胞混合刺激劑/106個細胞，放置恒溫箱(5%CO237 ℃)培養5 h，避光孵育CD4、CD25、CD45RA抗體15 min；按照操作手冊細胞破膜后避光孵育FoxP3、IL-17抗體20 min，應用Beckman流式細胞儀分析Treg細胞亞群、CD4+CD25+FoxP3+IL-17+水平。

1.3.3 細胞分選：BD FACS Arial Ⅱ流式分選儀分選實驗鼠外周血、脾臟、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜的FrⅢ亞群細胞。

1.3.4 FoxP3、IL-17、RORC mRNA檢測：應用RNeasy Micro Kit(Qiagen)提取FrⅢ亞群細胞總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。用Real-time PCR(SYBR Green方法)檢測FoxP3、IL-17 RORC mRNA水平。

2 結果

2.1 UC模型鼠不同組織中Treg細胞亞群的變化

2.1.1 UC模型組小鼠不同組織中FrⅠ亞群細胞水平變化及分布特點：UC模型鼠的脾臟、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜中FrⅠ亞群細胞水平顯著高于正常對照組(P<0.01)，而外周血中兩組間比較差異無統計學意義(P=0.3442，見表3)。

UC模型鼠中結腸固有層黏膜中FrⅠ亞群細胞水平顯著高于腸系膜淋巴結、脾臟、外周血、回腸固有層黏膜(P<0.01)，腸系膜淋巴結、脾臟、外周血、回腸固有層黏膜之間差異無統計學意義(P>0.05)；正常對照組中結腸固有層黏膜FrⅠ亞群細胞水平顯著高于外周血、脾臟、回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結(P<0.01)，脾臟與回腸固有層黏膜間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.2 UC模型鼠不同組織中FrⅡ亞群細胞水平變化及分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜中FrⅡ亞群細胞水平顯著低于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

UC模型鼠的結腸固有層黏膜中FrⅡ亞群細胞水平顯著高于外周血、回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結、脾臟(P<0.01)，脾臟、回腸固有層黏膜之間和腸系膜淋巴結、外周血之間差異無統計學意義(P>0.05)；正常對照組結腸黏膜固有層黏膜中FrⅡ亞群細胞水平顯著高于回腸固有層黏膜、脾臟、腸系膜淋巴結、外周血(P<0.05)，腸系膜淋巴結與外周血之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.3 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞水平變化及分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜中FrⅢ亞群細胞水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

組別只數FrⅠ型細胞FrⅡ型細胞FrⅢ型細胞CD4+CD25+FoxP3+IL-17+正常對照組 外周血50.345±0.0350.250±0.0442.628±0.4031.464±0.476 腸系膜淋巴結50.052±0.00960.250±0.0304.370±0.9701.450±0.400 回腸黏膜50.158±0.0180.880±0.0704.540±1.2202.530±0.990 結腸黏膜50.557±0.1201.310±0.2308.800±1.6503.180±0.640 脾臟50.120±0.00940.420±0.0906.750±1.3103.020±0.730UC模型組 外周血50.480±0.1260.160±0.033a5.526±0.707a2.280±0.592a 腸系膜淋巴結50.414±0.095a0.140±0.020a6.570±1.660a2.460±0.630a 回腸黏膜50.397±0.039a0.440±0.100a6.160±0.860a5.340±1.300a 結腸黏膜51.580±0.070a0.850±0.090a17.840±2.190a5.670±1.870a 脾臟50.452±0.074a0.370±0.0908.170±2.2003.300±0.930

注：與正常對照組比較，aP<0.05。

UC模型鼠結腸固有層黏膜中FrⅢ亞群細胞顯著高于腸系膜淋巴結、脾臟、回腸固有層黏膜、外周血(P<0.01)，腸系膜淋巴結、脾臟、回腸固有層黏膜中比較差異無統計學意義(P>0.05)；正常對照組結腸黏膜固有層黏膜中FrⅢ亞群細胞水平顯著高于脾臟、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、外周血(P<0.05)，腸系膜淋巴結與回腸固有層黏膜間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.4 UC模型鼠不同組織中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細胞水平變化和分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細胞水平顯著高于正常對照組(P<0.05)；脾臟中兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05,見表3)。

UC模型鼠結腸固有層黏膜中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細胞水平顯著高于脾臟、腸系膜淋巴結、外周血(P<0.05)，結腸固有層與回腸固有層比較差異無統計學意義(P>0.05)，腸系膜淋巴結與外周血差異比較無統計學意義(P>0.05)；正常對照組中結腸固有層黏膜顯著高于回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結、外周血(P<0.05)，脾臟與結腸固有層黏膜間比較差異無統計學意義(P>0.05)，腸系膜淋巴結與外周血間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 UC模型鼠不同組織FrⅢ亞群細胞中相關基因表達

2.2.1 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞FoxP3 mRNA表達：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜FrⅢ亞群細胞FoxP3 mRNA表達水平顯著低于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較FoxP3 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

UC模型和正常對照小鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞FoxP3 mRNA表達水平一致：脾臟和結腸固有層黏膜顯著高于外周血(P<0.05)，外周血、回腸黏膜固有層、腸系膜淋巴結之間差異無統計學意義(P>0.05)，脾臟、結腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2.2 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞IL-17A mRNA表達： UC小鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜FrⅢ亞群細胞IL-17A mRNA表達水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較IL-17A mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

UC模型鼠和正常對照小鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞IL-17mRNA表達分布水平一致：回腸固有層黏膜顯著高于結腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(P<0.05)，結腸固有層黏膜、外周血間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2.3 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細胞RORC mRNA表達： UC模型小鼠外周血、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜、結腸固有層黏膜FrIII亞群細胞RORC mRNA表達水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟兩組見比較IL-17A mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

UC模型鼠回腸固有層黏膜FrⅢ亞群細胞RORC mRNA表達水平顯著高于結腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(P<0.05)；正常對照組中回腸固有層黏膜顯著高于結腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(P<0.05)，外周血與結腸固有層黏膜比較差異無統計學意義(P>0.05)。

組別只數FoxP3mRNAIL-17mRNARORCmRNA正常對照組 外周血30.6296±0.06380.0432±0.00420.0458±0.0097 腸系膜淋巴結40.8999±0.10300.0044±0.00090.0043±0.0010 回腸黏膜30.8507±0.05060.2165±0.02380.2455±0.0708 結腸黏膜40.8613±0.01750.0458±0.01370.0697±0.0103 脾臟30.8427±0.02640.0118±0.00310.0135±0.0016UC模型組 外周血40.4180±0.0372a0.0944±0.0115a0.0926±0.0121a 腸系膜淋巴結30.5027±0.0548a0.0093±0.0011a0.0089±0.0002a 回腸黏膜30.4257±0.0832a0.4323±0.0567a0.5717±0.0046a 結腸黏膜30.6323±0.0103a0.1034±0.0142a0.1431±0.0101a 脾臟30.7501±0.08720.0191±0.00270.0162±0.0026

注：與正常對照組比較，aP<0.05。

3 討論

UC屬于炎癥性腸病的一種常見類型，病變累及結腸黏膜層。研究發現UC存在獲得性免疫異常，并且在UC的發病中起重要作用，尤其是Treg和Th17細胞[8]。Treg細胞通過細胞間的直接接觸或分泌IL-10和TGF-β等細胞因子作用于效應T細胞，發揮免疫抑制作用，維持機體免疫平衡以及免疫耐受[9-10]。Th17細胞屬于炎癥反應性細胞，特征性分泌IL-17A、IL-17F等促炎癥細胞因子對抗外來病原菌或異物[11]，此外，Th17細胞在IL-23促炎癥因子的協同下可以引起腸道黏膜和腸道益生菌群的破壞[12]。在正常機體中兩者處于動態平衡狀態，維持機體免疫平衡。研究[3]發現在UC腸道黏膜中，Treg細胞數量升高伴Treg細胞功能減退；而Th17細胞數量明顯升高，且Th17細胞浸潤水平與腸道炎癥反應呈正相關[13-14]。也有研究[15]報道在UC外周血中Treg細胞數量是升高還是降低存在差異，但發現其功能減弱，同時文獻[16]報道UC外周血Th17細胞數量增多。由此可見，在免疫反應方面UC患者中存在Treg細胞和Th17細胞之間的免疫失衡。

本研究將Treg細胞亞群的概念引入UC的研究，研究顯示FrⅢ水平升高而FrⅡ水平降低，提示真正發揮免疫抑制功能的Treg細胞減少，取而代之的是FoxP3低表達且沒有免疫抑制功能的FrⅢ升高。后者不但沒有免疫抑制功能，且有向Th17分化的潛能，表達IL-17，呈現FoxP3和IL-17共表達的特性。已有文獻[15]證實在炎癥性腸病(IBD)患者中外周血存在共表達FoxP3和IL-17A CD4+T細胞(IL-17和FoxP3 DE CD4+T cell)，同時表達RORγt和FoxP3 mRNA。這種細胞處于一種中間狀態，在CD4+T細胞因子(比如IL-1β、IL-2、IL-21等)的影響下，可以轉變為Th17細胞，同時發現IL-17和FoxP3 DE CD4+T細胞免疫抑制功能減少60%[15]。在IBD患者中，FoxP3和 IL-17A DE CD4+T細胞的存在是導致Treg細胞功能減退以及Th17細胞升高的原因[17]。本研究發現，UC模型鼠FrⅢ型細胞和CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細胞較正常對照組升高，FrⅢ型細胞共表達RORC和FoxP3 mRNA基因，提示FrⅢ型細胞是FoxP3和IL-17A DE CD4+T提供者。在UC的病態微環境中Treg細胞獲得轉化為Th17細胞的潛能，真正發揮免疫抑制功能的FrⅡ細胞數量減少，導致Treg細胞和Th17細胞失衡伴Treg細胞功能減退。

最初人們認為，初始T細胞(naive T)向Treg細胞分化過程中表達了FoxP3，并失去表達RORC的能力，但是近年來研究發現Treg細胞在某些因素的誘導下可重新獲得表達RORC的能力，從而向Th17細胞轉化，但是這種轉化主要發生在外周淋巴組織，而非中樞淋巴系統[18-19]。我們發現在UC模型樹中結腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜單個核細胞中共表達RORC和FoxP3 mRNA的FrⅢ亞群細胞比例升高，同時CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細胞主要存在于結腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜，說明FrⅢ型細胞轉化為Th17細胞的這一現象主要出現在外周淋巴組織，極少出現在脾臟中。提示在UC中，Treg獲得向Th17分化的潛能并失去正常功能，僅發生在外周淋巴組織，不發生在中樞淋巴系統。

FrⅠ亞群細胞是靜息狀態的細胞，可轉化為FrⅡ亞群功能細胞，本研究發現在UC模型鼠中，結腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結、回腸固有層黏膜單個核細胞中FrⅠ亞群數量增多，且在結腸固有層黏膜分布最多，提示UC模型鼠中FrⅠ的儲備是正常的，可能存在FrⅠ轉化障礙，其機制仍需進一步研究[5-6]。

綜上所述，UC存在Treg/Th17細胞失衡，在UC模型鼠中增多的FrⅢ亞群細胞共表達FoxP3、RORC mRNA，提示免疫抑制功能下降且存在轉化為Th17細胞的潛能。由此可見，FrⅢ亞群增多、FrⅡ亞群減少協同FrⅠ亞群轉化障礙可能是Treg細胞和Th17細胞失衡的原因，共同參與了UC的發病。

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(責任編輯：陳香宇)

The changes of regulatory T cell subsets in DSS-induced ulcerative colitis mice

MA Yahui1, ZHANG Jie1, SHAO Shulin1, XIAO Luyao1, LIU Xinjuan2

1.Department of Gastroenterology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029; 2.Department of Gastroenterology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, China

Objective To investigate the changes of regulatory T cell (Treg) subsets in ulcerative colitis (UC) mice. Methods Mice were randomly divided into UC group and healthy control group. The UC group were induced by 2.5% Dextran sulfate sodium (DSS) solution. The pathological manifestations of colon tissue were observed by Hematoxylin-Eosin staining. The Treg cell subsets and CD4+CD25+FoxP3+IL-17+were evaluated by flow cytometry, after extracting the mononuclear cells from peripheral blood (PB), spleen (SP), mesenteric lymph node (MLN), lamina propria (LP) of jejunum and colon in DSS-induced UC mice. And FoxP3, IL-17A, RORC mRNA extracted from FrⅢ cells were evaluated by Real-time PCR from above samples. Results In UC mice, the levels of FrⅠ subset cells were decreased among samples including SP, MLN, LP of jejunum and LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05); the levels of FrⅡ subset cells were decreased among samples including PB, MLN, LP of jejunum, LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05). While the levels of FrⅢ cells were increased among above samples compared with healthy control mice， as to the FoxP3, IL-17, RORC mRNA expressions extracted from FrⅢ cells. In UC mice, the expressions of FoxP3 mRNA were decreased among PB, MLN, LP of jejunum and LP of colon compared with healthy control mice, while the IL-17A and RORC mRNA were increased among above samples compared with healthy control mice (P<0.05). The levels of CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+cells were increased among samples including PB, MLN, LP of jejunum, LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05). Conclusion The decrease in FrⅡ cells and increase in FrⅢ cells together with a defect in FrI cells in the Treg cells are the reasons of the imbalance between Treg and Th17 cells.

Ulcerative colitis; Th17 cells; Regulatory T cell subsets

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.016

國家自然科學基金青年基金項目(81300294)

馬亞會，碩士，住院醫師，研究方向：TLR2介導的Treg細胞塑型在潰瘍性結腸炎腸黏膜Treg/Th17細胞間失衡中的作用機制研究。E-mail：18732854035@163.com

劉心娟，博士，副主任醫師，研究方向：TLR2介導的Treg細胞塑型在潰瘍性結腸炎腸黏膜Treg/Th17細胞間失衡中的作用機制研究。E-mail：lxjw2012@126.com

R574.62

A

1006-5709(2016)03-0294-05

2015-11-17