阿托伐他汀對人NK細胞殺傷HCT-116細胞的影響及其機制研究

姬會春，周 燏，劉軍權，陳復興，李 昳，費素娟

1.徐州醫學院研究生院，江蘇 徐州 221002； 2.中國人民解放軍第97醫院實驗科； 3.徐州醫學院附屬醫院消化科

阿托伐他汀對人NK細胞殺傷HCT-116細胞的影響及其機制研究

姬會春1，周 燏2，劉軍權2，陳復興2，李 昳2，費素娟3

1.徐州醫學院研究生院，江蘇 徐州 221002； 2.中國人民解放軍第97醫院實驗科； 3.徐州醫學院附屬醫院消化科

目的 探討阿托伐他汀對人自然殺傷細胞(natural killer，NK)殺傷HCT-116細胞的影響及其機制。方法 CCK-8法測定不同濃度的阿托伐他汀對HCT-116 細胞生長抑制率的影響。自動生化分析儀測NK細胞對HCT-116 細胞的殺傷活性；流式細胞儀(FCM)檢測HCT-116 細胞MICA/B的表達率。結果 不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116細胞48 h后在濃度為5～40 μmol/L及作用96 h后在濃度為1.25～40 μmol/L時，對HCT-116細胞的生長抑制率與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時，HCT-116細胞的生長抑制率在48 h組與96 h組相比，除5 μmol/L濃度組外差異均有統計學意義(P<0.05)。阿托伐他汀的濃度與HCT-116細胞的生長抑制率呈正相關(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05)。NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀濃度為2.5～10 μmol/L各組中均顯著高于對照組(P<0.05)。2.5 μmol/L濃度組及5 μmol/L濃度組，HCT-116細胞MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高(P<0.05)。結論 阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制HCT-116細胞的生長，且延長作用時間可以增強阿托伐他汀對HCT-116細胞生長的抑制作用；還能夠增強NK細胞對HCT-116殺傷活性；以及上調HCT-116細胞MICA/B的表達率，提高其免疫原性。

阿托伐他汀；HCT-116細胞；自然殺傷細胞；MICA/B

近年，隨著我國經濟的發展、人們生活習慣、飲食結構的改變及環境污染等，結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，新發病例以每年4%的速度增長，每年新發病例超過17萬，現已成為我國發病率上升最快的惡性腫瘤之一[1-2]，嚴重威脅著國人類的健康。他汀類藥物是臨床常用的降血脂藥物。近年來有研究表明，他汀類藥物具有抗腫瘤作用[3]。NK細胞是天然免疫細胞，臨床上NK細胞過繼免疫治療多種腫瘤已取得了一些療效。如何增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性是提高NK細胞抗腫瘤療效的關鍵。目前尚沒有阿托伐他汀與NK細胞聯合應用進行抗腫瘤研究的報道。本文擬探討阿托伐他汀對NK細胞殺傷HCT-116細胞的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)；人結腸癌細胞株HCT-116(低分化腺癌)(中科院上海細胞所)；CCK-8試劑盒(碧云天)；PE標記MICA/B、PE標記的CD3、FITC標記的CD56(美國BD公司)；ST-360酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)；Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司)；流式細胞儀(flow cymetory，FCM)(美國BD公司)。

1.2 HCT-116細胞的培養 復蘇后的HCT-116加入適宜的培養液，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中，2～3 d半量更換培養液，平均3 d傳代1次。待細胞鋪滿瓶底時用0.25%的胰酶消化脫壁，1 800 r/min離心6 min，離心半徑為13 cm，棄上清液，收集細胞用于實驗。

1.3 CCK-8檢測HCT-116細胞抑制作用 收集對數生長期的HCT-116細胞，PBS洗滌3次，將細胞配成1×104個/ml的細胞懸液加入96孔板內，培養24 h后加入不同濃度的阿托伐他汀，同時設DMSO 溶劑對照組，每組設3個復孔。置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養。分別于44 h、92 h時每孔加入CCK-8 20 μl，繼續培養4 h，輕輕搖勻，于酶標儀450 nm波長處測OD值。按下列公式計算結腸癌細胞的生長抑制率：生長抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 自動生化儀測定NK細胞殺傷活性 取對數生長期的HCT-116細胞予胰酶消化，洗滌3次，將細胞配成5×105個/ml的細胞懸液，加入6孔細胞培養板。分別將不同濃度的阿托伐他汀加入細胞培養板中，收集培養第48 h的HCT-116細胞，將細胞密度調整為2×105個/ml，作為靶細胞。以培養后的NK 細胞為效應細胞，調整細胞密度為2×106個/ml，按效靶比10∶1接種于試管中，置 37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養6 h，1 000 r/min離心5 min(離心半徑為13 cm)，吸取上清液，自動生化分析儀測乳酸脫氫酶(LDH)值。按下列公式計算NK細胞的殺傷活性：殺傷活性=(實驗組LDH值-效應細胞自然釋放組LDH值)/(靶細胞最大釋放組LDH值-靶細胞自然釋放組LDH值)×100%。

1.5 FCM檢測檢測MHC-I類鏈相關分子A/B(MICA/B)表達 收集HCT-116細胞，調整細胞密度為5×105個/ml，以每孔5 ml接種于6孔板內，加入不同濃度的阿托伐他汀，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養48 h，收集細胞，PBS洗滌，調整細胞密度至1×107個/ml，取細胞懸液100 μl，加入PE-MIC A/B 20 μl，室溫避光孵育15 min，同時設同型IgG1作為對照。PBS洗滌并重懸細胞，FCM檢測MICA/B的表達。

2 結果

2.1 不同濃度阿托伐他汀對HCT-116細胞生長抑制率的影響 作用48 h后，阿托伐他汀濃度為5～40 μmol/L的4個實驗組中及作用96 h后阿托伐他汀1.25～40 μmol/L的所有濃度組中，HCT-116細胞的生長抑制率與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時，HCT-116細胞的生長抑制率在48 h組與96 h組之間比較，除5 μmol/L濃度組外差異均有統計學意義(P<0.05,見表1)。另外，相關分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細胞的生長抑制率呈正相關(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05，見圖1)。

藥物濃度(μmol/L)HCT-116細胞生長抑制率48hOD值抑制率(%)96hOD值抑制率(%)0(對照組)1.81±0.0901.86±0.0801.251.78±0.082.08±0.181.69±0.098.36±0.18*△2.51.78±0.101.60±0.151.68±0.079.61±0.20*△51.74±0.083.79±0.38*1.69±0.088.51±0.28*101.75±0.083.52±0.34*1.63±0.0811.58±0.44*△201.68±0.097.26±0.14*1.61±0.0919.12±1.25*△401.42±0.0721.68±1.40*1.01±0.0645.46±1.96*△

注：與對照組比較，*P<0.05；與48 h組比較，△P<0.05。

注：與對照組比較，*P<0.05；與48 h組比較，△P<0.05。

圖1 不同濃度阿托他汀與HCT-116細胞生長抑制率的相關性分析

Fig 1 Correlation analysis of different concentrations of Atorvastatin and HCT-116 cell growth inhibition rate

2.2 不同濃度阿托伐他汀對NK細胞殺傷HCT-116細胞活性的影響 NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～10 μmol/L的3個濃度組中均顯著高于對照組(P<0.05)，其中5 μmol/L濃度組NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性最高(見表2)。

藥物濃度(μmol/L)LDH值HCT-116殺傷活性0(對照組)84.97±2.5640.23±2.342.5108.80±6.0259.32±3.90*5101.10±12.0462.30±2.46*1082.33±7.9850.42±5.64*2091.33±4.0845.32±2.394083.98±5.7339.43±5.46

注：與對照組比較，*P<0.05； 1.2 μmol/L濃度組與對照組比較差異無統計學意義，未作統計。

2.3 不同濃度阿托伐他汀HCT-116細胞MIC濃度組A/B表達的影響 在2.5 μmol/L濃度組及5 μmol/L濃度組，HCT-116細胞MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高(P<0.05)；40 μmol/L濃度組HCT-116細胞MICA/B表達率明顯降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

藥物濃度μmol/L)MICA/B表達率P值0(對照組)51.29±2.80—2.570.98±2.10<0.05564.87±3.27<0.051055.40±3.83>0.052042.42±4.47>0.054027.19±2.78<0.05

注：1.25 μmol/L濃度組與對照組比較差異無統計學意義，未作統計。

3 討論

結腸癌是一種發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，居我國男性惡性腫瘤發病率的第5位，女性的第3位[4]。由于結腸癌患者早期無明顯癥狀，臨床上確診時大都已發展為中晚期，錯過了最佳手術期，預后差、病死率高。為延長患者生存時間、提高患者生活質量，尋找新的、有效、低毒的治療藥物具有重要的臨床意義。目前結腸癌的發病原因尚不明確，最近有報道認為可能為自身免疫性疾病，細胞免疫與實體腫瘤的抗腫瘤機制有關[5]。越來越多臨床工作者研究利用藥物增強免疫細胞的抗腫瘤功能來達到腫瘤治療的目的。

他汀類藥物作為臨床常用的降血脂藥物，近年來人們還發現其具有抗腫瘤作用，但目前抗腫瘤的相關機制尚不明確，多項研究表明可能與以下機制有關：(1)他汀類藥物可通過抑制基因轉錄后的異戊二烯化從而抑制細胞生長，推測異戊二烯代謝物具有調節細胞增殖的作用[6]；(2)Ras突變是腫瘤發生過程中經常發生的事件，他汀類藥物可以抑制Ras蛋白翻譯后修飾，阻滯Ras信號傳導，從而影響細胞的增殖，并誘導細胞分化或凋亡。Park等[7]關于洛伐他汀對非小細胞肺癌細胞增殖研究中同樣證實了這一點；(3)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是細胞凋亡中起重要作用的一類蛋白水解酶，Caspase活化與凋亡的啟動有關，Bcl-2可阻礙細胞的凋亡過程。Cho等[8]通過小鼠結腸癌移植瘤動物實驗中發現辛伐他汀可上調Caspase-3蛋白表達，下調Bcl-2表達，誘導HCT-l16細胞凋亡。本實驗中應用不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116，結果顯示隨著阿托伐他汀濃度的升高，對HCT-116生長抑制作用逐漸增強，分析結果顯示兩者呈正相關，證實阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制HCT-116的生長，且延長作用時間可以增強阿托伐他汀對HCT-116細胞生長的抑制作用。

NK細胞是先天性免疫系統的重要組成部分，對靶細胞的識別無主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性，腫瘤細胞表達的MICA分子與NK細胞表面的活化型受體NKG2D交聯，可以促使NK細胞活化并產生穿孔素和顆粒酶裂解靶細胞，從而提高NK細胞對腫瘤的殺傷活性[9]。Pende等[10-11]研究發現，NK細胞對高表達MICA的腫瘤細胞殺傷活性明顯高于低表達者或者陰性者，殺傷活性增強的機理可能與腫瘤細胞MICA等配體的表達上調誘導NK細胞的活化有關。本實驗應用不同濃度阿托伐他汀作用48 h后的HCT-116與NK細胞配置成10∶1效靶比，發現NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀5～10 μmol/L時顯著高于對照組。證實阿托伐他汀可增強HCT-116細胞對結腸癌細胞殺傷活性，推測NK細胞的殺傷活性升高可能與阿托伐他汀提高HCT-116細胞NKG2D的配體MIC A/B表達有關。

MICA是位于HLA-B位點上游約46 kb的基因，具有多態性[12]，其編碼產物介導細胞應激時的信號轉導，該分子在正常細胞和組織中不表達，但癌變、感染或應激狀態可上調其表達，MICA具有免疫原性，是一種腫瘤相關抗原[13]。Li等[14]運用免疫組化檢測82例卵巢癌患者腫瘤組織MICA/B表達，結果表明腫瘤組織中MICA/B表達率高達97.6%，而正常組織中基本不表達。而Watson等[15]研究結果顯示結直腸癌MICA高表達可作為結直腸癌預后良好的指標之一。本實驗結果顯示不同濃度阿托伐他汀作用于HCT-116細胞48 h后，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組， MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高，差異有統計學意義，證實阿托伐他汀可以上調HCT-116細胞MICA/B的表達，增強其免疫原性，有利于NK細胞表面NKG2D受體的識別，提高NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性。

本研究證實阿托伐他汀能抑HCT-116細胞的增殖，能通過上調HCT-116細胞表達MICA/B，增強NKG2D受體識別MICA/B的能力，從而達到增強NK細胞殺傷HCT-116細胞敏感性。實驗研究表明兩者存在著藥物劑量的依賴性，如何找到一種安全合適劑量進行抗腫瘤治療是需要解決的問題。

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(責任編輯：馬軍)

The effect and mechanism of Atorvastatin on the cytotoxicity of human NK cells to HCT-116 cells

JI Huichun1, ZHOU Yu2, LIU Junquan2, CHEN Fuxing2, LI Yi2, FEI Sujuan3

1.School of Postgraduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002; 2.Department of Laboratory, the 97th Hospital of PLA; 3.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, China

Objective To investigate the mechanism of the cytotoxicity of NK cell induced by Atorvastatin to HCT-116 cells.Methods The effect of different concentrations of Atorvastatin on the growth of HCT-116 cells was measured by CCK-8. Automatic biochemical analyzer was applied to test the cytotoxicity of NK cells to HCT-116 cells. Flow cytometry (FCM) was used to detect the expression rate of MICA/B in the cells.Results Atorvastatin could inhibit the growth of HCT-116 cells, the inhitbition rates of HCT-116 were higher than those in the control group in different concentrations of Atorvastatin treatment 48 hours and 96 hours. Statistical analysis showed that the inhibition rates of HCT-116 had significant difference compared with the control group (P<0.05) when Atorvastatin was 5-40 μmol/L after 48 hours and 1.25-40 μmol/L after 96 hours. Correlation analysis showed that the concentration of Atorvastatin and the growth inhibition rate of HCT-116 cells were positively correlated(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05). The cytotoxicity of NK cells to HCT-116 cells was higher than the control group when Atorvastatin was 2.5-10 μmol/L (P<0.05). The expression of MICA/B on HCT-116 cells was higher than the control group (P<0.05) in the concentration of 2.5 μmol/L and 5 μmol/L.Conclusion Atorvastatin could inhibit the growth of HCT-116 cells in a dose-dependent manner; and it could enhance the cytotoxic activity of the NK cells to HCT-116 cells; it also could promote the expression of MICA/B on HCT-116 cells, and improve the immunogenicity of HCT-116 cells.

Atorvastatin; HCT-116; Natural Killer cells; MICA/B

南京軍區醫學科技創新課題(13MA039)

姬會春，碩士研究生，主治醫師，研究方向：消化道腫瘤免疫治療。E-mail：48587581@qq.com

費素娟，碩士，教授，碩士生導師，主任醫師，研究方向：消化系腫瘤的基礎與臨床研究。E-mail:feisj1031@ yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.019

R735.3

A

1006-5709(2016)03-0304-04

2015-06-04