幽門螺桿菌CagA和VacA基因型與IL-6、IL-8的關(guān)系研究

郭 皓，戚艷麗，張世同，李 慧，金建軍

1．河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽 471003； 2．河南省洛陽市宜陽縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科

幽門螺桿菌CagA和VacA基因型與IL-6、IL-8的關(guān)系研究

郭 皓1，戚艷麗2，張世同1，李 慧1，金建軍1

1．河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽 471003； 2．河南省洛陽市宜陽縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 觀察幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的不同基因型與IL-6、IL-8之間的關(guān)系，了解H.pylori的致病機制。方法 采集91例經(jīng)14C尿素呼氣試驗檢測為H.pylori(+)患者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對CagA、VacA進行定性分析，對IL-6、IL-8進行定量分析。結(jié)果 CagA(+)與CagA(-)中所含IL-6、IL-8含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.55、t=7.348，P<0.001)；VacA(+)與VacA(-)中所含IL-6、IL-8含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.418、t=6.977，P<0.001)；CagA、VacA均陽性中所含IL-6、IL-8的含量較CagA、VacA均陰性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.438、t=7.231，P<0.001)；CagA陽性患者血清中IL-6與IL-8含量呈正相關(guān)(r=0.672，P<0.01)，VacA陽性患者血清中IL-6與IL-8含量呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.01)。結(jié)論 CagA、VacA基因型與IL-6、IL-8之間有密切關(guān)系，IL-6、IL-8在H.pylori的致病機制中起重要作用，細胞因子在H.pylori感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)涉及多種細胞及多種細胞因子的相互作用。

幽門螺桿菌； 細胞毒素相關(guān)蛋白； 空泡細胞毒素； 白介素6； 白介素8

自1983年 Warren和Mashall從胃黏膜中分離出H.pylori后，國內(nèi)外對其研究逐漸深化，流行病學(xué)研究顯示發(fā)達國家成年人H.pylori感染率為30%～50%，而發(fā)展中國家則高達80%[1]。更深入、廣泛的研究發(fā)現(xiàn)其與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。關(guān)于H.pylori的致病機制，很多研究都提出空泡細胞毒素(Vacuolating cytotoxin A，VacA)和細胞毒素相關(guān)蛋白(Cytotoxin-associated protein，CagA)與H.pylori的致病有關(guān)，而也有部分研究表明免疫學(xué)功能紊亂學(xué)說也是本病的主要病理機制之一，認為細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及大量細胞因子的釋放，在H.pylori的病理過程中起著重要作用[3]。而白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)在兩者之中的表達更是研究熱點，因此本文旨在通過檢測感染不同基因型H.pylori患者血清IL-6、IL-8的含量，分析對比，推測H.pylori的致病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年9月-2014年11月在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科經(jīng)14C尿素呼氣試驗檢測為H.pylori(+)的患者共91例，男38例，女53例，平均年齡(50.16±15.33)歲。入選標(biāo)準：(1)所有病例經(jīng)14C尿素呼氣試驗提示H.pylori感染，并均有胃鏡檢查結(jié)果，其中慢性淺表性胃炎43例、慢性隆起糜爛性胃炎9例、十二指腸球部潰瘍9例、平坦糜爛性胃炎8例、反流性食管炎5例、胃潰瘍5例、霉菌性食管炎3例、賁門炎3例、食管癌2例、胃息肉2例、幽門黏膜慢性炎2例；(2)排除嚴重心、腦、肝、腎以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；(3)排除4周內(nèi)使用過影響H.pylori的藥物，如質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、抗生素、鉍劑、非甾體類消炎藥等；(4)無HIV感染，無免疫系統(tǒng)疾病，近3個月內(nèi)未使用過激素及免疫調(diào)節(jié)劑；(5)非腫瘤患者及孕婦。入選對象均于治療前清晨空腹抽取肘靜脈血3 ml，室溫下靜置1 h使血液自然凝集，離心30 min(4 000 r/min)，收集上清液血清約500 μl，分裝后放入-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2 研究方法

1.2.1H.pylori檢測：采用14C尿素呼氣試驗。儀器購自深圳中核海得威生物科技有限公司。

1.2.2 CagA和VacA檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)檢測CagA及VacA。

1.2.3 IL-6、IL-8含量測定：采用ELISA法，以上酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均為美國TSZ公司生產(chǎn)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司分裝，嚴格按照說明書進行操作。首先將經(jīng)14C尿素呼氣試驗檢測為H.pylori(+)的91例患者，進行CagA和VacA的測定，然后進行血清IL-6、IL-8含量測定，再進行分層對比分析。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清IL-6、IL-8含量的比較 CagA陽性患者血清中IL-6、IL-8含量均高于CagA陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VacA陽性患者血清中IL-6、IL-8含量均高于VacA陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別例數(shù)IL-6IL-8CagA(+)2126.722±12.7601603.83±521.202CagA(-)698.374±2.534741.867±238.640t值6.557.348P值<0.001P<0.001VacA(+)2027.134±12.8801608.08±530.658VacA(-)708.518±2.873752.967±256.586t值6.4186.977P值<0.001<0.001

注：有1例患者未完成檢測。

2.2 CagA、VacA均陽性與CagA 、VacA均陰性者血清IL-6、IL-8的含量比較 CagA、VacA均陽性患者血清中IL-6、IL-8含量高于CagA、VacA均陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

組別例數(shù)IL-6IL-8CagA(+)VacA(+)1927.598±13.0601637.672±527.969CagA(-)VacA(-)688.228±2.240737.982±234.488t值6.4387.231P值<0.001<0.001

2.3 CagA、VacA陽性者血清IL-6、IL-8的含量的相關(guān)性分析 CagA陽性者血清中IL-6與IL-8含量呈正相關(guān)(r=0.672，P<0.01)；VacA陽性者血清中IL-6與IL-8含量也呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.01，見圖1～2)。

圖1 CagA陽性患者血清IL-6、IL-8含量的相關(guān)性分析

圖2 VacA陽性患者血清IL-6、IL-8含量的相關(guān)性分析

3 討論

研究[4]顯示，H.pylori是一種高度變異的菌種，其基因含有1 590個編碼序列，具有多態(tài)性，正是這種高度的變異性及多態(tài)性決定了H.pylori的毒力和致病性，從而導(dǎo)致H.pylori感染后出現(xiàn)不同臨床結(jié)局，其致病性的差異與其毒力基因型的多態(tài)性密切相關(guān)， 包括VacA基因和CagA基因及相應(yīng)基因表達的蛋白質(zhì)的致病性有關(guān)。

VacA基因包括兩個顯著多變的區(qū)域，即AA端編碼信號肽第二部分約50 bp的S區(qū)和中間約700 bp的m區(qū)。所有H.pylori菌株的S區(qū)分為s1a、s1b、s1c、s2；m區(qū)分為m1a、m1b、m2三型。由不同信號序列和不同中間序列而構(gòu)成的不同H.pyloriVacA基因型，不但與其H.pylori的毒力水平有關(guān)，而且有地區(qū)差異，其中以s1a/m1型空泡毒素毒性最強，s1/m2次之，而s2/m2則無細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)s1/m1型與胃癌和胃潰瘍有關(guān)，s2/m2僅與胃潰瘍有關(guān)[5]。

結(jié)合H.pylori感染后臨床結(jié)局以及地區(qū)分布的多樣性提示了其致病機制的復(fù)雜性，研究表明，H.pylori致病機制涉及H.pylori菌株類型、炎癥、免疫、泌酸、氧化、遺傳等多個方面[6]。有毒力基因(CagA、VacA)、細胞因子(IL-4、IL-6、IL-8)、毒力因子(膜蛋白、脂多糖、黏附素等)、自由基等多種H.pylori致病因子參與，各種因子之間既各自獨立又相互影響。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)CagA(+)組與VacA(+)組中所含IL-6、IL-8含量高于CagA(-)組和VacA(-)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CagA、VacA兩種基因型的致病機制與IL-6、IL-8有密切關(guān)系，為進一步說明，我們又將CagA、VacA均陽性與均陰性者IL-6、IL-8含量進行比較發(fā)現(xiàn)，兩種基因型均陽性組明顯高于均陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

從細胞因子的角度出發(fā)，H.pylori感染后，H.pylori與宿主相互作用，介導(dǎo)機體對細菌的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致IL-6、IL-8、TNF等一序列細胞因子表達上調(diào)，這些炎性因子在H.pylori感染后胃黏膜表達增加[7]，通過本研究證明在兩種基因型陽性患者血清中，細胞因子L-6、IL-8的含量呈高濃度，進一步論證了在H.pylori致病機制中，細胞因子IL-6、IL-8起較大的作用，并認為這些細胞因子構(gòu)成一個復(fù)雜的炎性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并通過旁分泌、內(nèi)分泌等途徑，作用于B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞，使其在胃黏膜局部增殖、分化、激活，產(chǎn)生特異性和非特異性免疫反應(yīng)，損傷局部組織，導(dǎo)致胃腸疾病的發(fā)生。

IL-6是由單核巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種細胞產(chǎn)生的細胞因子，除具有免疫增強作用和造血促進作用外，還可參與炎癥反應(yīng)，Yamaoka等[8]研究顯示，H.pylori感染后胃黏膜上皮細胞IL-6 mRNA表達率明顯上升。IL-8主要由單核巨噬細胞、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1等細胞因子的刺激而產(chǎn)生，作為H.pylori相關(guān)胃炎發(fā)生、發(fā)展中的一個重要調(diào)節(jié)因子，其與CagA更為密切，研究證實，H.pylori可通過微生物IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system，TISS)將CagA基因編碼的毒力蛋白注入胃黏膜上皮細胞中，并誘導(dǎo)胃上皮細胞IL-8的過度表達與分泌，進而將大量嗜中性粒細胞趨化到胃黏膜部位，并導(dǎo)致炎性反應(yīng)的加重[9]。童明宏等[10]研究顯示，H.pylori感染患者高毒力菌株血清IL-8的水平高于低毒力菌株及未感染組，并認為H.pylori感染胃黏膜上皮細胞誘導(dǎo)分泌IL-8，且具有菌株特異性，即表達CagA的菌株其誘導(dǎo)分泌的IL-8水平高于不表達CagA的菌株。通過細胞因子間的相關(guān)性分析，本研究顯示H.pylori感染患者血清中IL-8與IL-6水平呈正相關(guān)，提示H.pylori感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)涉及多種細胞及多種細胞因子的相互作用，而細胞因子的持續(xù)存在將進一步增強細胞對感染的反應(yīng)，導(dǎo)致病變的加劇及延續(xù)。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，在兩組基因型的IL-6、IL-8濃度上，IL-8的濃度均明顯高于IL-6，提示IL-6在CagA、VacA的表達以及參與程度較IL-8弱。

綜上所述，H.pylori致病基因與宿主細胞因子間可能存在協(xié)同效應(yīng)，這種交互效應(yīng)的存在有助于解釋H.pylori感染臨床結(jié)局的復(fù)雜性，在探索方式上已經(jīng)從單一的致病因素發(fā)展成現(xiàn)在從細菌-環(huán)境-宿主三方面及其相互作用中尋找答案，隨著研究的深入，一些新的問題同樣值得關(guān)注，如H.pylori既能逃逸宿主免疫防御而持續(xù)定植于胃黏膜，又能激發(fā)機體免疫反應(yīng)致胃黏膜損傷，其機制仍不明確；IL-8蛋白陽性表達率從淺表性胃炎、胃潰瘍、萎縮性胃炎逐漸上升，可能參與胃癌前病變的進展模式，并促進腫瘤細胞形成、轉(zhuǎn)移，值得進一步探討[11]。如果能對IL-6、IL-8因子的刺激、分泌通路進行干預(yù)，將其向抗感染免疫、減輕免疫病理損害方面引導(dǎo)，以減輕細胞因子導(dǎo)致的一系列炎癥反應(yīng)會為治療提供新的靶點，目前針對H.pylori的基因疫苗已經(jīng)開始研制，總之，對H.pylori感染后細胞因子的變化及意義進行深入研究，有助于對H.pylori相關(guān)胃腸疾病的認識，并可能為該類疾病的診斷、治療提供新的手段。

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(責(zé)任編輯：李健)

The study of the relationship between Helicobacter pylori CagA and VacA genotype and IL-6， IL-8

GUO Hao1, QI Yanli2, ZHANG Shitong1, LI Hui1, JIN Jianjun1

1.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, and College of Clinical Medicine of He’nan University of Science and Technology, Luoyang 471003; 2. Department of Gastroenterology, Yiyang County Poeple’s Hospital, China

Objective To observe the pathogenesis of Helicobacter pylori (H.pylori), and the relationship between different genotypes ofH.pyloriand IL-6, IL-8.Methods Ninety one patients serum who detected theH.pyloripositive through 14 carbon urea breath tests were collected, the qualitative analysis of CagA, VacA and the quantitative analysis of IL-6, IL-8 were made by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results There was statistical significance in the contents of IL-6, IL-8 in CagA(+) and CagA(-) (t=6.55,t=7.348,P<0.001). There was statistical significance in the contents of IL-6, IL-8 in VacA(+) and VacA(-) (t=6.418,t=6.977,P<0.001). There was statistical significance in the contents of IL-6, IL-8 in both CagA, VacA positive and both CagA, VacA negative(t=6.438,t=7.231，P<0.001). The contents of IL-6, IL-8 in serum of CagA positive patients were positively correlated (r=0.672,P<0.01). The contents of IL-6, IL-8 in serum of VacA positive patients were positively correlated (r=0.664,P<0.01).Conclusion There was close relationship between genotypes of CagA, VacA and IL-6, IL-8. IL-6, IL-8 play important roles in the pathogenic mechanism ofH.pylori.

Helicobacter pylori; Cytotoxin-associated gene A; Vacuolating cytotoxin A; Interleukin-6; Interleukin-8

郭皓，在讀碩士研究生，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診治。E-mail：xinxianggh@126.com

金建軍，碩士研究生，教授，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的診治。E-mail：jjj0379@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.011

R573

A

1006-5709(2016)03-0279-04

2015-05-16