煙草節桿菌肌酸酶的高效異源表達與應用分析

戴　俊，康　振，張琳培，陳　堅，堵國成*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

煙草節桿菌肌酸酶的高效異源表達與應用分析

戴俊1，2，康振1，2，張琳培1，2，陳堅1，2，堵國成1，2*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

肌酸酶（CRE）是臨床檢測血液和尿液中肌酐的關鍵酶之一。作者成功地從煙草節桿菌23710（Arthrobacter nicotianae 23710）中克隆了CRE基因，并實現了CRE在Escherichia coli BL21（DE3）中的表達。經過硫酸銨分級沉淀、陰離子交換色譜、分子篩后得到了較純的重組CRE，比酶活達到了20.25 U/mg。重組CRE對于螯合劑EDTA、表面活性劑（Tween20，和Triton X-100）以及常用的防腐劑NaN3有很好的耐受性。

肌酸酶；煙草節桿菌；重組酶表達；應用分析

肌酐是人體中重要的代謝產物，血液中肌酐含量一般維持在35～150滋mol/L，多余的肌酐將通過腎臟系統排到體外［1］。一旦人體腎臟功能出現問題，肌酐無法隨尿液排出，血液中的肌酐含量就會隨之升高，測定血液和尿液中肌酐的含量就可以出反應腎臟功能［2］。目前臨床使用酶法對肌酐進行檢測，酶法主要由3個酶促反應組成，其中的3種關鍵酶分別為肌酐酶（Creatininase，EC 3.5.2.10）、肌酸酶（Creatinase，簡稱為CRE，EC 3.5.3.3）以及肌氨酸氧化酶（Sarcosine oxidase，EC 1.5.3.1）［3］。

CRE作為酶法測定肌酐中的關鍵酶，可以將肌酸分解為肌氨酸和尿素［4］。在自然界中，很多種類的菌株可以在誘導條件下產生CRE，這些菌株包括：芽孢桿菌屬（Bacillus）［5］、黃桿菌屬（Flavobacterium）［3］、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）［6］、節 桿 菌 屬（Arthrobacter）［2］、產堿桿菌屬（Alcaligenes）［7］、副球菌屬（Paracoccus）［8］、梭菌屬（Clostridium）［9］等。相應地，針對野生菌產生的CRE也有純化、性質分析以及評估等相關的研究［10］。智強等人成功地從篩選的A.nicotianae 02181中純化出CRE，并進行了性質分析，結果發現，該CRE具有良好的酶學性質，然而野生菌的CRE產量很低［11］，不適合應用工業進行大規模的生產。因此，通過構建細胞工廠來生產出具有良好性質的CRE是必需的。

在本研究中，作者成功克隆了來源于A.nicotianae 23710和Pseudomonas putida KT2440 的CRE基因，隨后分別構建重組菌實現了CRE的異源表達，并分析了兩種重組菌的表達情況。最后對來源于A.nicotianae 23710的重組CRE進行了應用性質分析。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株和質粒A.nicotianae 23710：購自于中國工業微生物菌種保藏管理中心 （CICC）；菌株E. coli JM109、E.coli BL21（DE3）、Lactobacillus reuteri CICC6124、P.putidaKT2440和 質 粒pMD19、pET20b：均為作者所在實驗室保藏。

1.1.2主要試劑Primer Star DNA聚合酶、限制性內切酶、Solution I DNA連接酶、瓊脂糖、感受態制備試劑盒、膠回收試劑盒：TaKaRa公司（大連）；氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、質粒提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒：上海生工生物有限公司；蛋白胨、酵母粉：Oxoid公司；標準相對分子質量蛋白質、上樣蛋白質緩沖液、SDS-PAGE預制膠：LifeTechnologies公司；其它試劑均為進口分裝或國產。

1.1.3主要溶液的配制

1）對-二甲氨基苯甲醛溶液：稱取2 g對-二甲氨基苯甲醛，溶于100mL二甲亞砜，加入15mL鹽酸。

2）肌酸溶液：稱取1.492 g肌酸，溶于90 mL PBS緩沖液中并定容至100 mL，要求在使用前配置。

3）PBS緩沖液（50 mmol/L）：分別配制0.2 mol/L 的NaH2PO4和0.2 mol/L Na2HPO4母液以備用，取95mL0.2mol/LNaH2PO4，155mL0.2mol/L Na2HPO4，加入去離子水并定容至1 000 mL。

1.1.4培養基

1）LB培養基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10。

2）TB培養基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，K2HPO416.43，KH2PO42.32。

3）檢測培養基（g/L）：酵母粉 0.1，蛋白胨 1，葡萄糖1，NaCl 5，KH2PO42，肌酸1，酚紅0.012。

1.2實驗方法

1.2.1重組質粒的構建根據NCBI數據庫中查詢到其它來源的CRE基因序列，設計引物ACRE-F、ACRE-R、PCRE-F、PCRE-R，引物序列見表1。以ACRE-F、ACRE-R為引物，A.nicotianae 23710基因組為模板進行PCR擴增；以PCRE-F、PCRE-R為引物，P.putida KT2440基因組為模板進行PCR擴增。將得到的CRE基因分別連接pMD19-T，得到質粒pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，進行測序。用 NdeI和 XhoI分別雙酶切 pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，與同樣進行雙酶切的pET-20（b）進行連接，連接液轉入E.coli JM109后提取質粒進行酶切驗證。

表1　　引物序列Table 1　Primer sequence

1.2.2CRE的誘導表達將驗證正確的質粒轉入E.coli BL21（DE3）中，挑取單菌落接入20 mL LB培養基中，37℃培養12 h，轉速為220 r/min。將生長好的種子液以體積分數5%接種至TB發酵培養基中，37℃進行培養。待OD600達到0.6時，接入IPTG進行誘導，并把溫度降至30℃誘導10 h。

1.2.3CRE的平板檢測預先在LB平板上將L.reuteri CICC6124指示菌和需要檢測的菌株分別劃線，待劃線菌落長到一定大小，挑取指示菌單菌落于檢測平板上，并將待檢測菌株接種于指示菌的附近，將平板放置于30℃培養箱進行培養，觀察平板上顏色變化［11］。

1.2.4CRE的活性測定在試管中加入900滋L肌酸溶液，在室溫中平衡5 min后加入100滋L待測酶液，在37℃反應10 min，然后向反應體系中加入2 mL對-二甲氨基苯甲醛溶液終止反應，并置于25℃溫育20 min，在435 nm處測定吸光度值，以水調零。空白管是在肌酸溶液中先加入對-二甲氨基苯甲醛，后加入待測酶液，其它步驟與測定管一致。

單位酶活定義：1 min內將肌酸水解產生 1 滋mol尿素所需要的酶量。

1.2.5CRE的純化方法將發酵液12 000 r/min離心10 min，除去上清液，用純水將菌體洗滌兩次后加入適量的PBS緩沖液懸浮細胞。在冰浴條件下利用超聲破碎儀對重組大腸桿菌進行破碎。對破碎后的懸浮液進行硫酸銨分級沉淀，取飽和度為60%～80%的沉淀部分，以PBS緩沖液溶解沉淀并透析過夜。透析后，利用微孔濾膜（0.25滋m）去除酶液中的雜質，利用AKTA蛋白純化儀進行純化，使用的柱子為陰離子交換柱（HiPrep 16/10 Q_XL）。上樣緩沖液（A液）為50 mmol/L的PBS緩沖液，而洗脫緩沖液（B液）為加有1 mol/L NaCl的50 mmol/L的PBS緩沖液。以A液進行上樣并平衡30 min，之后以B液進行線性洗脫，收集洗脫蛋白質。將有酶活的收集液用凝膠柱（HiLoad 16/60 superdex 200）進一步純化，緩沖液為50 mmol/L的PBS緩沖液。

1.2.6化學物質對CRE影響的分析在酶液中添加一定濃度的化學物質，在0℃保持30 min，測定酶活，并與不添加任何化學物質的酶液酶活進行比較。

2結果與討論

2.1CRE重組菌的構建

以A.nicotianae 23710和P.putida KT2440基因組為模板分別擴增cre基因，凝膠電泳見圖1。在1.2 kb處都有一條DNA條帶，與預期相符。對來源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因進行測序，測序結果見圖2。將測序結果與之前報道的肌酸酶序列進行比對，發現A.nicotianae 23710與A.nicotianae 02181來源的CRE基因同源性為91.7%，P.putida KT2440與P.putida GB-1來源的CRE基因同源性為93.3%，而不同屬來源的CRE同源性較低，A.nicotianae 23710和P.putida KT2440來源的CRE基因同源性僅為65.1%。

圖1CRE基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of CRE gene

對pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre雙酶切，回收片段后連接到表達載體 pET20b上，并轉入E.coli JM109中。經過菌落PCR初步驗證得到陽性重組子，接種過夜培養后提取質粒進行酶切驗證，酶切成功說明重組質粒pET20b-Acre與pET20b-Pcre構建成功。將驗證正確的質粒轉入E.coli BL21 （DE3）得到重組表達菌株E.coli BL21A和E.coli BL21P。

在設計引物時，在下游引物中加入了TAA終止密碼子。在pET20b質粒上，Xho I酶切位點后有His-tag，如果不加入終止密碼子，表達的蛋白質C-端會帶有幾個組氨酸。之前為了方便后續的CRE純化，沒有加終止密碼子，將CRE與His-tag融合表達。雖然外源蛋白質在重組菌中表達了出來，但均沒有CRE活性。這可能是因為CRE的活性位點位于肽鏈的C-端附近，加入了His-tag可能會影響蛋白質的二級結構，導致表達的蛋白質沒有CRE酶活。

2.2重組菌的表達

2.2.1平板檢測檢測平板中含有肌酸，如果待檢測菌產CRE，可以分解肌酸得到尿素。而L.reuteri CICC6124可以將尿素分解產生氨，使周圍培養基pH升高，從而使培養基中的pH指示劑酚紅改變顏色。在檢測平板上分別接種如下菌株：指示菌L.reuteri CICC6124、陰性對照菌E.coli BL21（pET20）、待檢測菌E.coli BL21A、E.coli BL21P，觀察生長情況。平板檢測結果見圖3。可以發現，在E.coli BL21A、E.coli BL21P周圍均有紅色，且E.coli BL21A周圍的顯色反應比E.coli BL21P還要強烈，而E.coli BL21（pET20）周圍卻沒有明顯紅色，說明重組菌E.coli BL21A和E.coli BL21P可以產CRE。

2.2.2SDS-PAGE分析和酶活檢測將搖瓶發酵液1 000 r/min離心10 min，去除上清液，以PBS緩沖液懸浮細胞。在0℃下破碎細胞，破碎完全后離心，取上清液分別進行SDS-PAGE分析和酶活檢測。SDS-PAGE分析結果見圖4。在相應大小處重組菌上清液均有明顯條帶，而E.coli BL21（pET20）沒有明顯條帶，說明CRE在重組菌中實現了表達，且表達量較高。

圖2　　來源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因序列Fig.2　CRE genes from A.nicotianae 23710 and P.putida KT2440

圖3CRE酶活平板檢測Fig.3　Determination　oftheCRE　activitywith　an indicator plate

酶活檢測測得原始菌A.nicotianae 23710的酶活為190.19 U/g，P.putida KT2440酶活為54.92 U/g，而重組菌 E.coli BL21A酶活為 1 834.04 U/g，E.coli BL21P酶活為1 380.92 U/g。可以發現重組菌酶活要遠高于原始菌酶活，而兩種重組菌相比之下，E.coliBL21A比E.coliBL21P的酶活高出32.8%。

圖4　　重組CRE SDS-Pisis of recombinant CRE

2.3重組CRE的純化

CRE的整個純化過程是由硫酸銨沉淀、陰離子柱純化、分子篩構成的。由于細胞內雜蛋白質含量比較多，不利于目的蛋白質與陰離子柱的結合，需要先去除一部分雜質。硫酸銨沉淀作為一種溫和的不易使蛋白質變性的純化方法被廣泛應用，所以在使用陰離子柱純化之前，選擇硫酸銨沉淀以去除部分雜蛋白質并濃縮目的蛋白質。進行硫酸銨分級沉淀時，發現重組CRE主要在硫酸銨濃度為60%～80%條件下析出。

CRE的理論等電點（PI）在5.0左右，在pH為7.0的條件下帶負電荷，因此可以選擇陰離子交換色譜作為純化的第二步。發現在15%～20%B的洗脫條件下，出現了一個峰形很好的洗脫峰，經酶活檢測確實為CRE的洗脫峰。

此純化方法操作方便，且操作步驟較少，可以快速制備純化樣品（見圖5），以便對重組CRE的進一步分析。

對純化的兩種重組CRE進行比酶活測定，結果E.coli BL21A的CRE比酶活為20.25 U/mg，而E.coli BL21P的CRE比酶活為9.0 U/mg。E.coli BL21A的CRE比酶活相比之下高很多，且E.coli BL21A的產酶量較高，所以將E.coli BL21A作為后期的主要研究對象。

圖5重組CRE純化過程SDS-PAGE分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of the purification process of the recombinant CRE

2.4重組CRE的應用分析

在實際應用中，CRE需要滿足一些條件。首先，CRE的最適溫度在35～45℃之間，最適pH在7.0～9.0之間。其次因為在制備酶試劑盒時，需要在其中加入一定量的NaN3作為防腐劑，所以要求CRE能夠在一定濃度的NaN3下保持酶活。最后就是CRE的純度要求，保證干擾應用的有害雜酶——過氧化氫酶在2%以下。根據以上在實際應用中的CRE的要求對E.coli BL21A所產的重組CRE進行應用分析。

2.4.1溫度、pH對重組CRE的影響考察了溫度、pH對重組CRE的影響，結果與來源于A.nicotianae 02181的CRE基本一致，最適反應溫度為37℃，最適反應pH為7.5［12］。

2.4.2化學物質對重組CRE的影響分析了部分化學物質對重組CRE的影響，結果見表2。首先分析了NaN3對CRE的影響，NaN3能夠抑制細胞色素氧化酶的活力從而抑制細菌的生長，在CRE的應用過程中作為防腐劑存在。分別設置了3種不同濃度的NaN3進行分析，結果發現NaN3對CRE沒有顯著影響。之后又分析了幾種工業中常用的表面活性劑和螯合劑對CRE的影響，發現SDS能夠使CRE完全失活，而螯合劑EDTA和其它類型的表面活性劑 （Tween20和Triton X-100）對CRE沒有抑制作用。

表2　　不同化學物質對CRE的影響Table 2　Effect of chemicals on CRE activity

2.4.2重組CRE的純度檢測對重組CRE進行純化后測定其中過氧化氫酶酶活，結果發現純化的重組CRE中檢測不到過氧化氫酶活性，滿足應用要求。

綜上，CRE的最適溫度為37℃，最適pH為7.5，能夠耐受NaN3，且純化的CRE中不含過氧化氫酶，因此滿足實際應用。

3結語

CRE作為酶法測定肌酐方法中的關鍵酶，在臨床檢測腎臟功能中起著重要作用。作者成功克隆來源于A.nicotianae 23710的CRE基因，并構建了重組表達菌E.coli BL21A。通過對重組菌E.coli BL21A進行誘導表達，發現重組菌酶活達到1 834.04 U/g，與原始菌的酶活190.19 U/g相比，提高了9.6倍之多。此外還對重組CRE進行了純化和性質分析，所采用的純化方法簡單有效，可以快速得到較純CRE進行分析。重組CRE的最適反應溫度為37℃，最適反應pH為7.5，在常用防腐劑NaN3的作用下也不會影響酶活。

本研究實現了CRE的高效表達，為降低肌酸水解酶的生產成本和擴大應用范圍奠定基礎。

［1］Eun J K，Tesrya H，Yasuko Y.Disposable creatinine sensor based on thick-film hydrogen peroxide electrode system［J］.Analytica Chimica Acta，1999，394（2-3）：225-231.

［2］Zhi Q，Kong P Y，Zang J T，et al.Biochemical and molecular characterization of a novel high activity creatine amidinohydrolase from Arthrobacter nicotianae strain 02181［J］.Process Biochemistry，2009，44（4）：460-465.

［3］Koyama Y，Kitao S，Yamamoto-Otake H，et al.Cloning and expression of the creatinase gene from Flavobacterium sp.U-188 in Escherichia coli［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1990，54（6）：1453-1457.

［4］Schumacher G，Hilscher W，Mollering H，et al.Engineering enzymes for clinical diagnosis［J］.Annales de Biologie Clinique，1993，51（9）：815-819.

［5］Suzuki K，Sagai H，Sugiyama M，et al.Molecular cloning and high expression of the Bacillus creatinase gene in Escherichia coli ［J］. Journal of Fermentation and Bioengineering，1993，76（2）：77-81.

［6］Hoeffken H W，Knof S H，Bartlett P A，et al.Crystal structure determination，refinement and molecular model of creatine amidinohydrolase from Pseudomonas putida［J］. Journal of Molecular Biology，1988，204（2）：417-433.

［7］Matsuda Y，Wakamatsu N，Inouye Y，et al.Purification and characterization of creatine amidinohydrolase of Alcaligenes origin［J］. Chemical&Pharmaceutical Bulletin，1986，34（1）：2155-2160.

［8］Wang Y Y，Ma X H，Zhao W F，et al.Study on the creatinase from Paracoccus sp strain WB1［J］.Process Biochemistry，2006，41 （9）：2072-2077.

［9］Minka H，Hans-Jugen K，Norbert M.Creatinine and N-methyhydantoin in two newly isolated Clostridium species［J］.Archives of Microbiology，1994，145：322-328.

［10］Yoshimoto T，Oka I，Tsuru D.Purification，crystallization，and some properties of creatine amidinohydrolase from Pseudomonas putida［J］. Journal of Biochemistry，1976，79（6）：1381-1383.

［11］Chang M C，Chang C C，Chang J C.Cloning of a creatinase gene from Pseudomonas putida in Escherichia coli by using an indicator plate［J］.Applied and Environmental Microbiology，1992，58（10）：3437-3440.

［12］羅侃，崔有宏，曾志南.煙草節桿菌02181肌酸酶的純化和理化特性［J］.甘肅科學學報，2006，18（1）：60-63. LUO Kan，CUI Youhong，ZENG zhinan.Purification and characteristics of creatinase from Arthrobacter nicotianae 02181［J］. Journal of Gansu Sciences，2006，18（1）：60-63.（in Chinese）

Expression and Application Analysis of Creatinase from Arthrobacter nicotianae

DAI Jun1，2，KANG Zhen1，2，ZHANG Linpei1，2，CHEN Jian1，2，DU Guocheng1，2*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Creatine amidinohydrolase（CRE）is one of the key enzymes for clinical determination of creatinine in serum and urine.In this study，the gene encoding for CRE was successfully amplified from Arthrobacter nicotianae 23710 and functionally overexpressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The recombinant CRE was purified through a series of operation including ammonium sulfate precipitation，anion exchange chromatography and gel filtration chromatography.The specific activity of the purified enzyme reached 20.25 U/mg.The recombinant enzyme shows excellent resistance to the chelating agent EDTA，the surfactants（Tween20 and Triton X-100）and the common preservative NaN3.

creatinase，Arthrobacter nicotianae，expression，application analysis

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0465—06

2014-09-30

國家863計劃項目（2011AA100905）；長江學者和創新團隊發展計劃項目（IRT1135）；國家博士后基金項目（2013M540414）；江蘇省自然科學基金項目（BK20141107）；江蘇省博士后基金項目（1301010B）。
*

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事代謝工程、發酵過程優化與控制等領域的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn