分泌表達(dá)蘋果酸乳酸酶的大腸桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建

王寧寧，劉　瑞，陳福生，張秀艷*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430070）

分泌表達(dá)蘋果酸乳酸酶的大腸桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建

王寧寧1，2，劉瑞1，2，陳福生1，2，張秀艷1，2*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430070）

蘋果酸乳酸酶（簡稱蘋乳酶）是果酒生產(chǎn)過程中蘋果酸乳酸發(fā)酵（簡稱蘋乳發(fā)酵）的關(guān)鍵酶。為了構(gòu)建分泌表達(dá)蘋乳酶的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，作者通過融合PCR將信號肽基因（487 bp）和蘋乳酶基因 （1 623 bp）的編碼序列連接在一起，將融合片段 （2110 bp）克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到陽性克隆子。IPTG誘導(dǎo)陽性克隆子后可得到相對分子質(zhì)量約為60 000左右的蛋白質(zhì)，利用HPLC可在其發(fā)酵上清液中檢測到240.7 mg/L的L-乳酸。這說明成功構(gòu)建了分泌表達(dá)蘋乳酶的大腸桿菌系統(tǒng)，該菌株的獲得將為蘋乳酶的研究和應(yīng)用提供了技術(shù)平臺。

蘋果酸乳酸酶；蘋乳發(fā)酵；分泌表達(dá)系統(tǒng)

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（簡稱蘋乳發(fā)酵）是果酒生產(chǎn)過程中非常重要的發(fā)酵過程，它是在乳酸菌的作用下將酸澀的L-蘋果酸轉(zhuǎn)化成口感柔和的L-乳酸，并產(chǎn)生CO2［1］，從而得到預(yù)期的酸度，除此之外還具有增加微生物學(xué)穩(wěn)定性、降低生澀味、增加香氣、使果酒的口感柔和等作用［2］。在蘋乳發(fā)酵過程中，由于果酒的低pH值，高SO2濃度，高酒精度等的影響而造成蘋乳發(fā)酵遲緩，導(dǎo)致生物胺或氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)等不良代謝產(chǎn)物，甚至導(dǎo)致蘋乳發(fā)酵終止不徹底而引發(fā)生物危害［3-4］。

針對這一問題，國內(nèi)外學(xué)者開展了系列研究，如向發(fā)酵液中加入蘋果酸乳酸酶（MLE）［5］，或通過細(xì)胞融合構(gòu)建降酸釀酒酵母［6-8］，或利用基因工程方法構(gòu)建降酸釀酒酵母等［9］。但對蘋果酸的轉(zhuǎn)化率都不高，這可能是因?yàn)镸LE不能很好地適應(yīng)果酒的環(huán)境。

因此，作者在擴(kuò)增MLE編碼序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建分泌型表達(dá)MLE的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)MLE的酶學(xué)性質(zhì)研究和酶學(xué)性質(zhì)改造奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒E.coli DH5α，E.coli BL21 （DE3），酒類酒球菌（Oenococcus oeni）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）：農(nóng)科院惠贈；pET28a（+）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3培養(yǎng)基E.coli DH5α，E.coli BL21（DE3）和枯草芽孢桿菌的保存和培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基；酒類酒球菌用ATB培養(yǎng)基；大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子用LB培養(yǎng)基或含1%L-蘋果酸的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1酒類酒球菌基因組DNA的提取，大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取參照文獻(xiàn)［10］。

1.2.2PCR反應(yīng)條件

1）蘋乳酶基因的PCR擴(kuò)增：根據(jù)已報(bào)道的酒類酒球菌中蘋乳酶基因序列設(shè)計(jì)引物，引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，上游引物 F（mle）：5'-CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGT-3'，下游引物R（mle）：5'-TCGCTCGAGTTAGTATTTCGG CT CCCAC-3'。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94 ℃30 s，58℃1.5 min，35個循環(huán)（兩步PCR反應(yīng)）；

2）信號肽基因的PCR擴(kuò)增：根據(jù)NCBI發(fā)布的Bacillus subtilis 168菌株β-葡聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)引物，引入NcolⅠ酶切位點(diǎn)和與蘋乳酶基因反向互補(bǔ)的堿基，上游引物F（sig）：5'-CATGCCATGGAA ACCTACATTGAGCGGGGAG-3'，下游引物R（sig）：5'-TACTTACTGGATCTGTCATTTGAGCTGAGGCAG TAGCAGTG-3'。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min、94℃30 s、55℃30 s、72℃40 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min；

3）信號肽基因和蘋乳酶基因的融合PCR：重新設(shè)計(jì)蘋乳酶基因的上游引物F（mle2）：5'-ATGACAGATCCAGTAAGT-3'，下游引物仍為R（mle）：5'-TCGCTCGAGTTAGTATTTCGGCTCCCAC-3'，5'端帶有EcoR I酶切位點(diǎn)CTCGAG和保護(hù)堿基TCG。融合PCR體系中信號肽基因和蘋乳酶 （摩爾比）以1∶1加入25 μL反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系其它成分組成同前。融合PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，58℃5 min，72℃ 2 min 30 s，15個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.3DNA的酶切、連接和測序酶切和連接按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，測序工作由南京金斯瑞公司完成。

《詩·小雅·常棣》：“死喪之威，兄弟孔懷。”《箋》：“死喪可畏怖之事，維兄弟之親甚相思念。”本為極其思念之意，后以孔懷指兄弟。《三國志·魏·管輅傳》“明年二月卒，年四十八”《注》引管輅弟辰作《輅別傳敘》：“辰不以闇淺，得因孔懷之親，數(shù)與輅有所諮論。”北齊顏之推《顏氏家訓(xùn)·文章》：“陸機(jī)《與長沙顧母書》，述從祖弟士璜死，乃言‘痛心拔腦，有如孔懷’。心既痛矣，即為甚思，何故言有如也？觀其此意，當(dāng)謂親兄弟為孔懷。 ”〔2〕8

1.2.4大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。

1.2.5大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)將活化好的陽性轉(zhuǎn)化子以體積分?jǐn)?shù)1%接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L卡那霉素），37℃、200 r/min下培養(yǎng) 2～3 h（OD600 nm=0.6～0.9），加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h。取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心15 min后去上清液；加50 μL 1×SDS上樣緩沖液到沉淀中，沸水浴10 min，離心后的上清液可用于SDS-PAGE檢測。

1.2.6陽性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)L-乳酸能力的分析陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)上清中加入終濃度為1 mmol/L NAD，0.5 mmol/L Mn2+，37℃反應(yīng) 1 h，取100 μL反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析。高效液相檢測條件：固定相為C18-EP柱；流動相為 20 mmol/L KH2PO4（pH 2.5）；流速為0.8 mL/min；檢測波長為210 nm。為了測試酶法分析乳酸方法在檢測發(fā)酵液中蘋乳酶活性的可行性，我們同時用乳酸檢測試劑盒檢測了反應(yīng)液中乳酸的含量，檢測方法參見Labarre等（1996）的方法。

2結(jié)果與分析

2.1分泌型表達(dá)MLE的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建

通過融合PCR將蘋乳酶基因編碼序列 （1 623 bp）和信號肽序列（487 bp）連接，得到大小為2 110 bp的片段，見圖1。用EcoR I和Ncol I限制酶切合片段和載體pET28a（+），通過T4連接酶將酶切片段連接以構(gòu)建重組載體pET28a（+）-mle，具體過程見圖2。將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂在含50 mg/L的卡那霉素的LB平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1　　信號肽和mle編碼序列及其融合片段Fig.1　Signal peptide and mle encoding sequence and the fused fragment

圖2　　重組質(zhì)粒pET28a（+）-mle構(gòu)建流程圖Fig.2　Flowchart for pET28a（+）-mle construction

2.2陽性轉(zhuǎn)化子的PCR和雙酶切驗(yàn)證

對篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，以含有pET28a（+）的菌株作為對照菌株。以F （sig）和R（mle）為引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在含有重組載體菌株中擴(kuò)增出大小為2 110 bp的片段，而對照菌株則未擴(kuò)增出片段，見圖3。用EcoR I和Ncol I限制酶對重組載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示：重組載體經(jīng)雙酶切后得到了大小為5 400 bp和2 110 bp的片段，而未經(jīng)切割的載體仍為7 369 bp，表明已經(jīng)得到了含有重組載體pET28a（+）-mle的陽性克隆子。

圖3　重組質(zhì)粒pET28a（+）-mle的PCR和雙酶切驗(yàn)證Fig.3　Verification of recombinant pET28a（+）-mle by PCR and enzyme digestion

2.3含重組載體pET28a（+）-mle的大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

按照方法1.2.5對陽性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE。以含有pET28a（+）的菌株作為對照。結(jié)果見圖4。可以看出，含有pET28a（+）-mle 的E.coli BL21在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后得到相對分子質(zhì)量大小約為60 000蛋白質(zhì)，與預(yù)期大小相符合；而在未經(jīng)誘導(dǎo)的含有pET28a（+）-mle的E.coli BL21，在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET28a（+）的E.coli BL21和E.coli BL21中未發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的表達(dá)。這說明分泌型表達(dá)蘋乳酶的重組表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功構(gòu)建。

圖4　陽性轉(zhuǎn)化子全蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖Fig.4　SDS-PAGE photogram of whole protein from transformants

2.4陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清中產(chǎn)生L-乳酸的分析

根據(jù)方法1.2.6用HPLC對陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液中的乳酸進(jìn)行分析，以 E.coli BL21和含pET28a（+）的E.coli BL21作為對照，分析圖譜見圖5-8。

圖5　L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（200 mg/L）的HPLC圖Fig.5　HPLC of L-lactic acid standard solution（200 mg/L）

圖6　E.coli BL21培養(yǎng)上清液中L-乳酸HPLC圖Fig.6　HPLC of L-lactic acid in supernatant ofE.coli BL21

圖7　　含pET28a（+）E.coli BL21培養(yǎng)上清液的 L-乳酸HPLC圖Fig.7　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET28a（+）

圖8　含pET28a（+）-mle E.coli BL21培養(yǎng)上清液的L-乳酸HPLC圖Fig.8　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET28a（+）-mle

由圖5可以看出，L-乳酸的保留時間是4.941 min。由圖6-8可以看出，野生型和含pET28a（+）的E.coli BL21，在保留時間4.9 min附近無吸收，而含pET28a（+）-mle的E.coli BL21在4.943 min處有吸收，表明經(jīng)過誘導(dǎo)含有pET28a（+）-mle的E.coli BL21能夠表達(dá)蘋乳酶且能轉(zhuǎn)化蘋果酸為乳酸。通過外標(biāo)法計(jì)算出L-乳酸質(zhì)量濃度為240.7 mg/L。

同時用乳酸檢測試劑盒（酶法檢測原理）檢測各菌株發(fā)酵上清液中L-乳酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。

表1　　乳酸試劑盒檢測培養(yǎng)上清中L-乳酸質(zhì)量濃度Table 1　L-lactic acid content detected with L-lactic acid assay kit

由表 1可以看出，野生和含 pET28a（+）的E.coli BL21的培養(yǎng)上清液中未檢出 L-乳酸，和HPLC檢測結(jié)果相一致。含pET28a（+）-mle的E.coli BL21上清液中檢出L-乳酸的質(zhì)量濃度為252.8 mg/L，比HPLC法檢出的結(jié)果稍大，這說明含pET28a（+）-mle的E.coli BL21外分泌的MLE有活性，具有將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸的能力。乳酸檢測試劑盒可用于蘋乳酶活性的檢測。

3結(jié)語

作者將來自枯草芽孢桿菌的β-葡聚糖酶的信號肽序列與蘋乳酶基因的編碼序列融合并克隆入載體pET28a（+）中，成功構(gòu)建了分泌型表達(dá)蘋乳酶的載體。含有該載體的E.coli BL21能夠成功地誘導(dǎo)表達(dá)蘋果酸乳酸酶，表達(dá)的蘋果酸乳酸酶能夠轉(zhuǎn)化蘋果酸產(chǎn)生乳酸，分別用HPLC和乳酸檢測試劑盒在發(fā)酵上清液中檢測到240 mg/L和252.8 mg/L的乳酸。

同時作者將含有信號肽編碼序列MLE插入表達(dá)載體pET22b（+）中，成功構(gòu)建了重組載體pET22b （+）-mle，見圖9。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在IPTG誘導(dǎo)的條件下，陽性克隆子能高效表達(dá)蘋乳酶，見圖10。但是其培養(yǎng)上清液中并沒有檢測到L-乳酸的存在，見圖11，這說明表達(dá)的MLE沒有活性，這可能是因?yàn)樵趐ET22b（+）表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)量雖然較高，但信號肽不能有效地引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入周至空間和細(xì)胞外，而在胞內(nèi)的蛋白質(zhì)則可能因?yàn)闆]有來得及正確折疊而無法發(fā)揮其活性。

圖9pET22b（+）-mle的PCR和雙酶切驗(yàn)證Fig.9　Verification ofpET22b（+）-mle by PCR and double digestion

圖10 蘋果酸乳酸酶的SDS-PAGE圖Fig.10　SDS-PAGE analysis of MLE

圖11　　含pET22b（+）-mle E.coli BL21培養(yǎng)上清液的L-乳酸HPLC圖Fig.11　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET22b（+）-mle

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Construction of Secretory Escherichia coli Expression System of Malolactic Enzyme

WANG Ningning1，2，LIU Rui1，2，CHEN Fusheng1，2，ZHANG Xiuyan1，2*
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Malolactic enzyme（MLE）is a key enzyme inmalactic fermentation（MLF）during fruit-wine producing.In order to construct the secretory Escherichia coli（E.coli）expression system of MLE.The signal peptide gene（487 bp）and the MLE gene（1 623 bp）were combined through fusion-PCR，then the fused fragment was inserted into pET28a（+）and transformed into E.coil. 60 000 protein was obtained when the positive strain was cultured and induced with IPTG.240.7 mg/L L-lactic acids could be detected in the fermentation supernatant with HPLC.All the results indicated the secretory E.coli expression system of MLE was successfully constructed.This will provide a technical platform for the research and application of MLE.

malolactic enzyme，malactic fermentation，secretory expression system

Q 78

A

1673—1689（2016）05—0498—06

2014-10-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071588）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2662015PY068）。
*

張秀艷（1973—），女，河南南陽人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail：xiuyanzhang73@mail.hzau.edu.cn