ARTP誘變及高效篩選高產葡萄糖氧化酶菌株

肖成建，陳　楠，江　慰，羅　瑋，王　強，李漢廣，余曉斌*

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

ARTP誘變及高效篩選高產葡萄糖氧化酶菌株

肖成建1，陳楠1，江慰2，羅瑋1，王強1，李漢廣1，余曉斌1*

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

以黑曲霉為出發菌株，采用常壓室溫等離子體（ARTP）注入技術對前培養后的出發菌株進行誘變，并結合改進后的鄰聯茴香胺高效平板顯色圈進行初篩及搖瓶復篩。獲得一株產葡萄糖氧化酶高產菌株，其產量由出發菌的45.6 U/mL提高到85.3 U/mL。通過對發酵關鍵條件碳酸鈣和吐溫-80添加量進行優化，結果顯示酶活提高到125.6 U/mL，較原始菌株提高了175.4%。經6代傳代培養，產葡萄糖氧化酶性能穩定。

常壓室溫等離子體；鄰聯茴香胺顯色圈；葡萄糖氧化酶；誘變；黑曲霉

葡萄糖氧化酶 （Glucose oxidase簡稱GOD）作為一種需氧脫氫酶，能在有氧條件下專一地將β-D-葡萄糖催化生成過氧化氫和D-葡萄糖-δ-內酯，且D-葡萄糖-δ-內酯會自發地進一步轉化為葡萄糖酸［1-2］。在發酵工程、食品添加劑、生物傳感器、動物飼料添加劑、生化材料和檢測試紙等方面葡萄糖氧化酶都有著廣泛的應用［3］。目前，黑曲霉和青霉是大規模生產葡萄糖氧化酶最主要的菌株，但我國工業生產葡萄糖氧化酶的活性、純度以及酶的穩定性都普遍偏低，長期依賴于進口［4-5］。常壓室溫等離子體 （Atmospheric and Room Temperature Plasmas，簡稱ARTP）誘變育種經過長期實踐，證明其有對操作者安全、操作簡單、環境友好、突變率高、突變快速、獲得的突變株性能穩定的特點，目前成功應用于包括細菌、真菌、放線菌、酵母、微藻等在內的40多余種微生物的誘變育種［6］。因此，作者采用常壓室溫等離子體誘變育種技術并結合理性篩選模型獲得一株高產葡萄糖氧化酶菌株，并對發酵條件進行優化以提高該菌產酶能力。

1材料與方法

1.1菌種

作者所在實驗室保存，具有產葡萄糖氧化酶能力的黑曲霉菌株。

1.2培養基

1.2.1固體平板培養基（g/L）馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；pH自然。

1.2.2種子培養基（g/L）蔗糖 70，魚蛋白胨 10，玉米粉 15，吐溫-80 15，KH2PO40.2，（NH4）2HPO40.4，MgSO4·7H2O 0.2。

1.2.3發酵培養基（g/L）蔗糖 85，牛肉膏 3.5，玉米粉 15，（NH4）2SO417，（NH4）2HPO40.6，KH2PO40.3，吐溫-80 20，CaCO335；pH 5.5。

1.3常壓室溫等離子體（ARTP）誘變

首先用無菌的種子培養液將已成熟（斜面培養5 d）的黑曲霉孢子洗下，加入玻璃珠于搖床180 r/min、30℃振蕩培養6 h（前期培養）。用無菌脫脂棉過濾即得到處于萌發狀態的孢子懸液，調整孢子懸液濃度為106個/mL。打開ARTP紫外殺菌預熱20 min，設定誘變處理參數。等離子工作氣體為氦氣，設定工作電源功率120 W，氣體流速為12 L/min，照射距離2 mm。吸取孢子懸液涂布于小鋼板上，每個鋼板涂布菌懸液10 μL。照射處理時間為0～240 s。用無菌生理鹽水將照射處理完的孢子洗下，涂布于篩選平板。通過菌落形成單位，計算菌株致死情況，并以此繪制致死率曲線［7］。誘變后顯色圈直徑大于誘變前的菌株顯色圈直徑5%以上的記為正突變菌株，正突變菌株數除以總顯色菌株數記為正突變率。

1.4篩選

1.4.1初篩利用雙層平板進行高產葡萄氧化酶的初步篩選，下層平板為葡萄糖10 g/L，鄰聯茴香胺0.1 g/L，辣根過氧化酶0.05 g/L（200 U/mg）和瓊脂粉20 g/L；上層平板為20 g/L的瓊脂粉。為了保證酶的活力，待培養基溫度降低至50℃左右時候，加入辣根過氧化酶。經誘變處理后的孢子，涂布在篩選平板上，30℃培養24 h，根據呈現的棕色圈的大小，挑選棕色圈較大的進行復篩［8］。

1.4.2復篩將初篩得到的菌株接種到發酵培養基，200 r/min、30℃培養48 h，測定各自酶活，挑選出產酶提高大的菌株。

1.5酶活測定方法

15 mL刻度管里加入1 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；2.9 mL鄰聯茴香胺葡萄糖溶液（0.01 g鄰聯茴香胺溶解于8 mL甲醇，取5.25 mL加水定容到100 mL。再加入10%的葡萄糖溶液；葡萄糖溶液與鄰聯茴香胺溶液比為16：100）；100 μL辣根過氧化物酶（60 U/mL）；在38℃水浴鍋振蕩預熱20 min。取發酵液稀釋10倍，制成粗酶液，水浴預熱20 min。取酶液50 μL加入刻度管，振蕩反應60 s，加入2 mL濃鹽酸（5 mol/L）終止反應。置于涼水使得反應顏色穩定。

酶活單位定義：在上述實驗條件下，一分鐘內葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產生1 μmol過氧化氫所需酶量為一個單位U。

1.6遺傳穩定性分析

連續傳代6代，分析所篩選的高產菌株產葡萄糖氧化酶的能力和性能變化。

2結果與分析

2.1ARTP對菌株的致死率和正突變率曲線

經過長期使用ARTP技術對黑曲霉孢子誘變發現，黑曲霉孢子在較長的照射時間下仍然致死率低，同時發生正突變的菌株少。因此對孢子進行前期培養，以期提高ARTP的作用效果。圖1-2分別為經過前期培養和未經過前期培養進行誘變處理后致死率和突變率結果對比。

圖1　　菌株經過前期培養不同照射時間下的致死率和正突變率Fig.1　Death rate and positive mutation of the strain at different irradiation time after pre-culture

圖2　菌株未經過前期培養不同照射時間下的致死率和正突變率Fig.2　Death rate and positive mutation of the strain at different time without pre-culture

圖1-2分別為經過前培養和未經過前培養的誘變致死曲線和正突變曲線。可見黑曲霉孢子在經過前期的培養后，在僅照射時間不同的情況下，其達到相同的致死率所需要的照射時間明顯縮短。經過前期培養的孢子在照射時間120 s的時候，致死率達到95%以上。而沒有經過前培養的孢子，達到95%以上的致死率需要300 s以上。氦離子產生的活性粒子，一方面能夠破壞細胞結構；另一方面穿過細胞壁進入細胞內，打斷基因和蛋白質分子內鍵等。大部分的微生物因此死亡，也有小部分微生物通過修復系統而存活。而正是在這過程中發生了基因突變［9］。所以通過ARTP技術操作來快速獲得突變菌株成為可能。孢子前期培養萌發進入同步生長狀態，生理活性較高。進一步增強了離子對細胞的作用效果。經過前期培養后誘變的正突變率明顯高于沒有前培養菌的正突變率；當照射時間在90 s左右時，致死率在85%～95%的時候，正突變率最高，達到28%。因此確定誘變條件是，黑曲霉孢子經過前培養后，照射90 s左右，控制致死率在90%左右。

2.2葡萄糖氧化酶高產菌株的篩選

2.2.1初篩菌種選育是一項工作量巨大的工作，一種理性篩選模型能有效地減少工作量，提高選育效率。而在篩選高產葡萄糖氧化酶的黑曲霉工作過程中，有效的平板篩選能大量減少后續工作。圖3-4為鄰聯茴香胺顯色平板改進前后的顯色效果對比圖。

圖3　　改進前鄰聯茴香胺顯色Fig.3　Colour reaction of the O-diani sidine befor improvement

圖4　改進后鄰聯茴香胺顯色Fig.4　Colour reaction of the O-diani sidine after improvement

圖3為作者所在實驗室較早的鄰聯茴香胺顯色平板，是將氮源以及碳酸鈣混合倒入一層平板。雖然顯色反應很明顯，但是由于菌絲無規則蔓延和顏色的擴散，使得顯色圈不規則且平板都有擴散的褐色，難以區別產酶能力的差異。圖4為改進后將篩選平板分為不含氮源的下層和僅有瓊脂的上層。所形成顯色圈規則，且平板背景沒有顏色擴散。能夠更高效地篩選出產酶提高的菌株。因此應用本篩選方法，初篩后共獲得48株差異較大的正突變菌株。

常用的產葡萄糖氧化酶篩選平板有Fiedure.K.J顯色法、甲基紅顯色以及鄰聯茴香胺顯色等［10］。Fiedure.K.J顯色法，即在培養平板中加入淀粉以及碘化鉀。當微生物產生葡萄糖氧化酶與葡萄糖反應時，會伴隨過氧化氫的產生。過氧化氫與碘化鉀作用形成碘單質，并進一步與淀粉反應形成藍色圈。同樣的原理，與甲基紅反應形成紅色圈，與鄰聯茴香胺反應形成褐色圈。

由于顯色反應都比較靈敏，因此菌株產酶與否很容易通過顯色觀察判斷。但當菌株的產酶能力達到一定程度以后，這些顯色方法就難以區別菌株間產酶能力的提高與否。在碘化鉀平板顯色和甲基紅平板顯色過程中，篩選平板中容易形成很大的且形狀不規則的顯色圈，經常顏色擴散，覆蓋整個平板，導致難以區別篩選。本研究篩選平板為改進后的顯色平板，下層為鄰聯茴香胺、辣根酶以及葡萄糖混合瓊脂平板；上層為碳酸鈣瓊脂平板。碳酸鈣瓊脂層的存在，使得孢子在萌發過程中吸收營養成分受到限制。另一方面，在下層培養基中營養成分缺少氮源，進一步限制了孢子的生長。涂布于表面的孢子更多的靠細胞內的物質以及隔層的葡萄糖生長，在此過程中產生的葡萄糖氧化酶通過瓊脂層滲透與下層顯色物質反應，以形成規則且區別度大的褐色圈。改進后的篩選平板即有效的限制了菌絲的擴大，又很好的區別不同產酶能力的菌株。再將顯色圈大的菌株，挑選接種于營養豐富的平板繼續培養即可。

2.2.2復篩將初篩得到的48株正突變菌株進行發酵培養，48 h后依次測定每株的產酶能力，選出7株產酶能力提高大的菌株，分別命名為T1至T7，實驗結果見圖5。

圖5　　復篩突變菌株與原菌株產酶對比Fig.5　Enzyme production of the mutant strain and the parent strain

7株菌的產酶性能都有較大提高，其中菌株T6的產酶能力最強，達到85.3 U/mL，較對照菌株提高了87.8%。實驗結果表明，常壓室溫等離子體誘變相對于操作過程繁雜、環境要求高的常規化學誘變和紫外誘變是一種簡單、高效的誘變方法，能夠用于誘變篩選高葡萄糖氧化酶活力的黑曲霉菌株。

2.3突變株產酶性能研究

2.3.1胞外酶變化黑曲霉產葡萄糖氧化酶是一種半分泌酶，且不同菌株的胞外酶所占比例并不相同。當胞外酶比例大時更有利于酶的后期提取，故測定突變株胞外酶所占比例，結果見圖6。

圖6　突變菌株和原菌株不同培養時間下產胞外酶占總酶活比例Fig.6　Ratio of extracellular enzyme in total enzyme activity of the mutant and the parent strain at different culture time

由圖6可知，T6菌株與原菌株對比，總的酶活單位提高。而且在48 h培養總酶活達到最高時，胞外酶占總酶的比例也明顯高于原菌株。原菌株的胞外酶活比例達50%左右，而誘變菌株在48 h左右，胞外酶活比例達到76%，這將更便于酶的后期提取和純化。

2.3.2關鍵產酶激活劑效應碳酸鈣對葡萄糖氧化酶的分泌有著重要意義。一方面是菌體生長過程的載體，另一方面又可以中和反應產生的葡萄糖酸，從而可調節發酵液pH，因此是一種產酶促進劑。同樣吐溫-80作為一種有效的表面活性劑，加入發酵液大大提高了細胞膜的通透性，有利于酶的釋放，兩者對發酵產酶都有重要意義。因此以不同的添加量加入發酵，以找到最合適的碳酸鈣和吐溫-80的添加量，結果見圖7、圖8。

圖7為誘變前后菌株不同碳酸鈣添加質量分數下的產酶活力。經過誘變菌株與原菌株對比，最適碳酸鈣的添加質量分數由原來的3.5%提高到5.0%，酶活達到115.7 U/mL。如圖8所示，在最適碳酸鈣添加質量分數的基礎上，最適的吐溫-80添加質量分數由原來的2.0%變為3.0%，此時酶活達到125.6 U/mL。

圖7　　突變株和原菌株不同質量分數的碳酸鈣添加量下產酶對比Fig.7　Enzyme production of the mutant and the parent strain　atdifferent　concentrations　ofcalcium carbonate

圖8　突變菌株和原菌株不同吐溫-80的添加質量分數下產酶對比Fig.8　Enzyme production of the mutant and the parent strain at different concentrations of Tween 80

2.4產酶穩定性研究

為了檢測變異菌株T-6產酶的遺傳穩定性，連續培養6代，各代以優化后培養基為發酵培養基，于搖床上30℃發酵培養48 h。測定各代產酶活量，實驗結果見圖9。

從圖9可以看出，傳代6代中產酶活力雖然有所波動，但都在120 U/mL左右，第四代和第六代略微有點降低。總體誘變菌株T-6具有較好的遺傳穩定性。

圖9　　不同傳代數下產酶能力差異Fig.9　Enzyme production of the mutant during generations

3結語

作者構建了黑曲霉產葡萄糖氧化酶菌株的ARTP快速誘變和有效篩選方法，并對影響產酶發酵關鍵條件進行優化。主要結論如下：通過黑曲霉前培養，有效地提高了相同處理條件下的正突變發生率。最高的正突變率能達到28%。通過改良后的鄰聯茴香胺顯色平板，使得平板能形成均勻對比性強的顯色圈，因此該方法是一種篩選產葡萄糖氧化酶高活力菌有效方法，很大程度上提高了篩選效率。對發酵條件進行了優化，誘變菌株最大產酶活力達到125.6 U/mL，較出發菌株提高了175.4%，且具有良好的遺傳穩定性。相對于常規的誘變處理，ARTP誘變技術是一種高效、安全的誘變方式，實踐證明能有效作用于黑曲霉產葡萄糖氧化酶菌株，獲得高產突變株。但與2014年報道朱運平等人［11］對發酵條件優化后最高葡萄糖氧化酶產量達到363.04 U/mL還有一定的差距，通過選育優良菌株以及優化培養條件來一步提高產酶能力是今后研究的方向。同時，我國工業生產葡萄糖氧化酶活力普遍偏低、純度不高，長期依賴進口，如何更經濟有效的制取高純度的葡萄糖氧化酶也有待解決。

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Screening Mutation of High Glucose Oxidase Activity Using Atmospheric and Room Temperature Plasmas

XIAO Chengjian1，CHENG Nan1，JIANG Wei2，LUO Wei1，WANG Qiang1，LI Hanguang1，YU Xiaobin1*
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Pre-cultured Aspergillus niger was treated using ARTP for the development of high glucose oxidase strain.Improved O-dianisidine color-developing circle method was used for preliminary screening and the mutant strains were re-screened by liquid state fermentation in flasks. Mutant strain T-6's enzyme activity increased from 45.6 U/mL to 85.3 U/mL and was selected for its high glucose oxidase-producing ability.Glucose oxidase activity reached 125.6 U/mL which was 175.4%higher than that of the original strain when the critical fermentation conditions，calcium carbonate and Tween-80 were optimized.The genetic expression of glucose oxidase was showed to be stable when the strain was cultured for 6 generations.

ARTP，O-dianisidine color-developing circle，glucose oxidase，mutagenesis，Aspergillus niger

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0525—06

2014-10-23

江蘇省自然科學基金項目（BK20130130）。
*

余曉斌（1965—），男，安徽蕪湖人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵健康食品和酶技術方面的研究。E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn