鋅對大鼠骨髓間充質干細胞增殖與向神經樣細胞分化的影響

嚴　珺，王永杰，孟春陽，李　雷，趙嘉勛，郭貴君，彭川莉，尹　飛，郭　麗*

(1．吉林大學公共衛生學院 衛生毒理學教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學中日聯誼醫院 骨科,吉林 長春130033)

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鋅對大鼠骨髓間充質干細胞增殖與向神經樣細胞分化的影響

嚴珺1，王永杰1，孟春陽2，李雷1，趙嘉勛1，郭貴君1，彭川莉1，尹飛2，郭麗1*

(1．吉林大學公共衛生學院 衛生毒理學教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學中日聯誼醫院 骨科,吉林 長春130033)

摘要：目的探討鋅對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)增殖及向神經樣細胞誘導分化的作用。方法貼壁法體外分離培養BMSCs，MTT法檢測不同濃度的鋅處理BMSCs 24 h、48 h及72 h后增殖活性。免疫細胞化學法檢測不同濃度的鋅處理BMSCs Ki67的表達。BMSCs分空白對照組、缺鋅誘導組、正常誘導組、低濃度鋅處理組和高濃度鋅處理5組。除空白對照組外，其余4組在含有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)誘導分化培養基中培養5 d，維甲酸繼續培養14 d，誘導BMSCs向神經樣細胞分化。倒置顯微鏡觀察細胞生長形態；免疫細胞化學法檢測膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)的表達。結果MTT結果顯示，細胞暴露在鋅濃度為200×10-7mol/L時，不同時間點細胞活力均最強；免疫細胞化學法顯示：缺鋅組Ki67陽性表達顯著低于空白對照組(P<0.05)，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達顯著高于空白對照組、缺鋅組和高濃度鋅處理組(P<0.05)；缺鋅組、正常誘導組和低濃度鋅處理組GFAP和NSE陽性率顯著高于空白對照組和高濃度鋅處理組(P<0.05)，正常誘導組和低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率顯著高于缺鋅組(P<0.05)，低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著高于正常誘導組(P<0.05)。結論鋅在一定濃度范圍內能夠提高BMSCs增殖能力及促進BMSCs向神經樣細胞分化。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞；鋅；增殖；分化

(ChinJLabDiagn,2016,20:1045)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類可以自我更新、具有強大增殖能力以及多向分化潛能的干細胞[1，2]。有研究證實，通過化學等誘導物在體內或體外適宜條件下可以使BMSCs分化為神經樣細胞，為修復中樞神經系統退行性疾病以及神經功能障礙帶來新的希望，引起越來越多的各界學者的關注[3，4]。但BMSCs在體外經過幾次傳代培養后，細胞的增殖及分化潛能下降，因此人們一直尋找增加BMSCs增殖和分化功能的處理因素。鋅是細胞中各種酶的必需組成成分，在機體的生長發育中扮演重要角色。有研究證明，鋅不僅對神經干細胞的存活有著重要影響，而且對其增殖、分化以及誘導產生神經元起關鍵作用[5，6]。但對于鋅在BMSCs向神經樣細胞分化過程中的作用研究卻較少。本研究對鋅對BMSCs的增殖和向神經樣細胞分化影響作用進行了探討。

1材料與方法

1.1動物和主要試劑一周齡健康SD大鼠，購自吉林大學實驗動物中心；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)購自PeproTech公司；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗體購自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離培養一周齡SD大鼠置于超凈工作臺中，脫頸處死，于75%酒精滅菌，無菌條件下將骨髓腔中的細胞沖入含DMEM-F12培養液的廣口瓶中，制成單細胞懸液，以1×106/mL細胞密度接種于75 mL培養瓶，于5%CO2、飽和濕度孵箱中培養。3 d后換半液，7 d左右以1∶2傳代。

1.2.2Zn對BMSCs增殖的影響①MTT法 將第三代BMSCs細胞懸液，以每孔5×103個細胞、200 μl的密度接種于96孔培養板。次日分別換成不同濃度硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)(0、50×10-7、100×10-7、200×10-7、400×10-7、800×10-7、1 600×10-7、3 200×10-7)mol/L的培養液，設4個復孔，培養24 h、48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μl，孵育4 h，在490 nm波長的酶聯檢測儀上測量各孔吸光度值(OD值)，計算細胞活力。②細胞增殖抗原Ki67的檢測待第三代BMSCs細胞長滿蓋玻片后分空白對照組、缺鋅組(每毫升血清中添加0.1 g Chelex-100螯合樹脂)、低濃度鋅處理組(200×10-7mol/L)、高濃度鋅處理組(1600×10-7mol/L)四組，培養3 d。預冷的95%乙醇固定20 min，干燥后-20℃保存用于免疫細胞化學法檢測。

1.2.3BMSCs的分化待第三代BMSCs細胞長滿蓋玻片后分空白對照組、缺鋅組(Chelex-100螯合樹脂+誘導劑)、正常誘導組、低濃度鋅處理組(200×10-7mol/L Zn+誘導劑)、高濃度鋅處理組(1600×10-7mol/L Zn+誘導劑)五組(低、高鋅濃度由MTT篩選)。除空白對照組外，其他組在含有bFGF、EGF誘導分化培養基中培養5 d，維甲酸繼續誘導14 d。95%預冷的乙醇固定20 min，晾干、-20℃保存。

1.2.4免疫細胞化學法檢測GFAP、NSE蛋白以及Ki67蛋白的陽性表達取出細胞片，0.5%Triton X-100溶液孵育20 min，內源性過氧化物酶阻斷劑孵育30 min，動物非免疫血清封閉30 min，一抗孵育(Ki67、GFAP、NSE，1∶200)過夜，生物素標記的第二抗體孵育30 min，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶30 min， DAB顯色，蘇木精染核，脫水、透明，封片，顯微鏡觀察。

2結果

2.1BMSCs的培養

細胞接種于培養瓶24 h后見少量細胞貼壁，細胞形態多為圓形。48 h后貼壁細胞逐漸增加，形成大小不同的細胞集落。72 h后細胞逐漸增大，呈長梭形或多角形，換半液。7 d后傳代，傳代后細胞以梭形為主。

2.2Zn對BMSCs增殖的影響

2.2.1MTT結果MTT結果顯示，BMSCs在暴露于不同濃度Zn2+24 h、48 h和72 h的條件下，細胞在200×10-7mol/L濃度時，BMSCs活力達到最頂峰，顯著高于對照組(P<0.05)(見圖1)。結果表明在一定劑量范圍(0-200×10-7mol/L)內，隨著Zn濃度增長，細胞增殖能力增強，在Zn濃度為200×10-7mol/L時，活力最強。隨著鋅濃度進一步增加(200×10-7mol/L-1600×10-7mol/L)，細胞活力下降；隨著作用時間的增加，細胞活力下降。

2.2.2增殖抗原Ki67的表達免疫細胞化學法顯示，缺鋅誘導組Ki67陽性表達顯著低于空白對照組(P<0.05)，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達顯著高于空白對照組與缺鋅誘導組(P<0.05)，高濃度鋅處理組Ki67陽性表達顯著低于空白對照組和低濃度鋅處理組(P<0.05)(見圖2)。

圖1　不同時間點不同濃度鋅對BMSCs細胞活力增殖曲線

A.空白對照組400×；B.缺鋅組400×；C.低濃度鋅處理組400×；D.高濃度鋅處理組400×；E.aP<0.05，與空白對照組比較；bP<0.05，與缺鋅組比較；cP<0.05，與低濃度鋅處理組比較

圖2免疫細胞化學檢測增殖抗原Ki67的表達

2.3誘導BMSCs分化的神經樣細胞標志蛋白的表達

免疫細胞化學法顯示，不同組有不同程度GFAP和NSE的表達。與空白對照組比較，缺鋅組、正常誘導組和低濃度鋅處理組GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)；同時，與缺鋅組比較，正常誘導組和低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)，與正常誘導組比較，低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)，高濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率顯著低于缺鋅組、正常誘導組和低濃度鋅處理組(P<0.05)(見圖3)。

3討論

近年來研究發現，由于BMSCs不存在取材困難以及倫理之爭等諸多優勢已經作為組織工程及細胞和基因治療的種子細胞[7]。BMSCs在適宜誘導條件下，能夠定向分化為神經樣細胞，為治療中樞神經系統損傷和退行性疾病帶來新的希望。

aP<0.05，與空白對照組比較；bP<0.05，與缺鋅組比較；cP<0.05，與正常誘導組比較；dP<0.05，與低濃度鋅處理組比較

圖3誘導BMSCs分化的神經樣細胞標志蛋白的表達

本研究對鋅在BMSCs向神經樣細胞分化過程中的作用進行了探討，鋅作為生物體重要的營養物質，在細胞的生化過程中發揮不同的作用，包括生長、分裂以及酶系統的活動中都體現著重要功能[8]。本實驗采用不同處理組來研究鋅對BMSCs增殖活力的影響，MTT結果表明在達到閾值之前，隨著Zn濃度增加，細胞增殖活力增強，鋅含量過高不利于細胞增殖，細胞活力下降。Ki67是與細胞增殖相關的抗原，其功能與有絲分裂密切相關。為了進一步驗證鋅對BMSCs增殖活力的影響，本實驗采用免疫細胞化學法檢測細胞增殖標志蛋白Ki67的表達，缺鋅組Ki67陽性表達率顯著低于空白對照組，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達率顯著高于空白對照組、缺鋅組和高濃度鋅處理組，這一結果與MTT結果相符合，說明適宜濃度的鋅能夠促進BMSCs增殖，而鋅濃度增加到一定閾值，增殖能力反而下降甚至起到抑制作用。

以往研究表明BMSCs在體外條件下可以分化為神經樣細胞，已經作為治療神經系統疾病有前景的干細胞[9]。我們的研究中，與空白對照組比較，缺鋅誘導組與正常誘導組GFAP和NSE陽性表達率顯著升高，提示BMSCs具備向神經樣細胞分化潛能。在正常誘導組與低濃度鋅處理組陽性率顯著高于缺鋅誘導組，而且，低濃度鋅處理組顯著高于正常誘導組，提示在適宜鋅濃度處理下能夠促進BMSCs向神經樣細胞分化。我們的研究結果中，GFAP和NSE在高濃度鋅處理組陽性表達率低于缺鋅組、正常誘導組以及低濃度鋅處理組，表明鋅濃度過高對BMSCs向神經樣細胞分化起到抑制作用。鋅是人體必須的微量元素之一，不能通過簡單擴散跨越細胞膜進入細胞，需要特殊的膜蛋白轉運體協助下才能進入細胞。有研究表明，器官或細胞中鋅的動態平衡是由ZnT和ZIP膜蛋白介導，ZnT能夠調節胞質內鋅離子外流或使細胞內鋅區室化，來減少細胞內鋅含量。ZIP則相反，作為鋅轉運體，它通過調節細胞對鋅的攝入或調節細胞器釋放鋅來增加胞漿內的鋅含量[10，11]。但在我們的研究中，對于ZnT和ZIP如何調節鋅含量的研究機制還不夠明確，需進一步深入研究。

綜上所述，一定濃度的鋅能夠提高BMSCs增殖活性，促進BMSCs向神經樣細胞分化，但鋅如何發揮調控BMSCs的分化的機制仍需進一步研究。

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基金項目：國家自然科學基金(81573067)；吉林省科技廳科技發展計劃項目資助課題(20130413023GH)；吉林省衛生計生科研計劃項目

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1045-04

中圖分類號：Q813

文獻標識碼：A

(收稿日期：2016-04-15)

Effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells

YANJun1,WANGYong-jie1,MENGChun-yang2,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells.MethodsBMSCs were isolated by adherence and cultured in vitro.MTT method was used to detect the proliferation activity of BMSCs treated with different concentration zinc in 24 h,48 h,72 h.The Ki67 expression in BMSCs administrated by different concentration zinc were detected by immunocytochemical method.The third generation BMSCs were divided into five groups,including blank control group,zinc deficiency group,normal induction group,low concentration zinc treatment group and high concentration zinc treatment.Apart from the blank control group,BMSCs in the other four groups were cultured for 5 days in differentiation induction culture medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF),then were induced to differentiate into neural-like cells in the culture medium with retinoic acid for 14 days.Cell growth morphology was observed by inverted microscope.The expression of glial fiber acidic protein (GFAP) and neuron specific enzyme (NSE) were detected by immunocytochemistry.ResultsMTT assay showed cell viability of BMSCs exposed to 200×10-7mol/L zinc were highest at different time points;immunocytochemistry results showed that Ki67-positive cells percentage of BMSCs in zinc deficiency group was lower than that in blank control group (P<0.05),Ki67-positive cells percentage of BMSCs in low zinc treatment group was significantly higher than those in the blank control group,zinc deficiency group and high zinc treatment group (P<0.05);GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in zinc deficiency group,the normal induced group and low zinc treatment group were significantly higher than those in blank control group and high zinc treatment group (P<0.05),and GFAP-positive and NSE- positive percentages of BMSCs in normal induced group and the low zinc treatment group were significantly higher than that in zinc deficiency group (P<0.05),GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in low zinc treatment group were significantly higher than those in normal induced group (P<0.05).ConclusionZinc can enhance the proliferation of BMSCs and promote the differentiation of BMSCs into neural-like cells in a certain concentration range.

Key words:Bone marrow mesenchymal stem cells;Zinc;proliferation;differentiation

(2014Z046)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(2015533));大學生創新訓練項目(2014A72312)