PM2.5對OVA所致大鼠變應(yīng)性鼻炎mTOR信號通路的影響

黃歆梅， 賀　鵬，黃連弟， 陳俊宇 ，許　多 ，陳鷺華 ，張　涵 ，張詠梅 ，滕　博* ，趙麗晶*

(1.吉林大學(xué)護理學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

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PM2.5對OVA所致大鼠變應(yīng)性鼻炎mTOR信號通路的影響

黃歆梅1， 賀鵬2，黃連弟3， 陳俊宇3，許多1，陳鷺華3，張涵1，張詠梅1，滕博2*，趙麗晶3*

(1.吉林大學(xué)護理學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀察可吸入顆粒物(PM2.5)對卵清蛋白(OVA)所致大鼠變應(yīng)性鼻炎(AR)的影響，并探討其作用機制。方法40只Wistar雌性大鼠隨機分為對照組、OVA對照組、PM2.5組和PM2.5+OVA組，以O(shè)VA基礎(chǔ)致敏及噴鼻激發(fā)制備大鼠變應(yīng)性鼻炎(AR)動物模型。血液分析儀檢測外周血中嗜酸性粒細(xì)胞百分比(Eos%)；ELISA方法檢測血清及鼻腔灌洗液中白三烯(LTB4)含量；免疫組織化學(xué)染色方法檢測mTOR信號通路相關(guān)蛋白。結(jié)果PM2.5顯著增加大鼠外周血中Eos% 以及血清和鼻腔灌洗液中LTB4含量，上調(diào)大鼠鼻黏膜上皮中mTOR、4EBP、EIF4E及HIF1α的表達(dá)。結(jié)論PM2.5可通過激活大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞mTOR信號通路，參與調(diào)節(jié)AR的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：細(xì)顆粒物(PM2.5)；變應(yīng)性鼻炎；mTOR信號通路

(ChinJLabDiagn,2016,20:1055)

近年來，直徑小于2.5 μM的細(xì)顆粒物(PM2.5)所致的大氣污染日益嚴(yán)重，區(qū)域性霧霾已成為急需解決的問題[1]。長期暴露于大氣污染會導(dǎo)致免疫和炎癥反應(yīng)功能障礙，增加罹患變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)和哮喘的風(fēng)險[2]。PM2.5對人類健康的影響已引起廣泛關(guān)注[3]，但有關(guān)PM2.5對AR影響的研究主要集中于流行病學(xué)，缺少動物實驗研究，且作用機制尚不明確。本研究制備大鼠AR模型，觀察PM2.5 對AR的影響，并探討PM2.5激活mTOR信號通路，破壞鼻粘膜固有免疫屏障的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物40只雌性Wistar大鼠購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體重180-220 g，自由攝食飲水，自然晝夜光線照明，維持室溫20±2℃，濕度60%±2%。

1.2主要試劑卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自上海永葉生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自eBioscience公司；單克隆抗體購于proteintech公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3PM2.5的采集與處理PM2.5采集于中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所大氣環(huán)境與遙感綜合觀測場，采集時間為2014年秋至2015年春。石英濾膜分別在采樣前和采樣后于20℃恒溫干燥24 h并稱重，載有顆粒樣品的石英濾膜剪成小塊，于超純水中超聲震蕩15 min，真空冷凍干燥，加入PBS制成顆粒物懸液，高壓滅菌后4℃避光保存。

1.4AR大鼠動物模型制備40只Wistar大鼠隨機分為對照組(CON)、OVA 組、PM2.5組和OVA+PM2.5組，以卵清蛋白基礎(chǔ)致敏及滴鼻激發(fā)制備大鼠AR模型。OVA組和OVA+PM2.5 組分別于第0和7天腹腔注射5% OVA混懸液，于第21天以5% OVA混懸液雙側(cè)滴鼻進行激發(fā)。對照組和PM2.5組分別給予生理鹽水。PM2.5組和OVA+PM2.5組大鼠分別于第7、14和21天滴鼻給予PM2.5 懸液(5 g/L，1 ml/kg)，對照組和OVA 組分別滴鼻給予等體積PBS。

1.5標(biāo)本采集與處理激發(fā)后24 h麻醉狀態(tài)下腹主動脈采血處死大鼠，分離血清-20℃保存。將硬膜外麻醉導(dǎo)管分別插入大鼠兩側(cè)鼻腔2 cm并固定，倒置大鼠后每側(cè)鼻腔用1 ml PBS灌洗2遍，收集鼻腔灌洗液，離心取上清，-20℃保存。取大鼠鼻腔呼吸區(qū)粘膜，10%甲醛固定，石蠟包埋切片。

1.6外周血中Eos%檢測取外周血20 μL，滴入0.38 ml嗜酸性粒細(xì)胞染色液，混勻后室溫靜置10 min，以自動血液細(xì)胞分析儀進行EOS計數(shù)。

1.7鼻腔灌洗液及血清中LTB4檢測采用雙抗體夾心ELISA 法測定，按照說明書進行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得所測樣品的濃度。

1.8mTOR信號通路相關(guān)蛋白檢測組織學(xué)切片脫蠟后水洗，以3% H2O2封閉內(nèi)源性酶，熱抗原修復(fù)后加正常血清封閉，先后加入特異性一抗和HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，中性樹膠封固。

2結(jié)果

2.1鼻腔灌洗液及血清中LTB4含量與對照組相比，OVA+PM2.5組大鼠血清及鼻腔灌洗液中LTB4含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2外周血中嗜酸性粒細(xì)胞比值與對照組相比，PM2.5與OVA聯(lián)合處理后，大鼠外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　PM2.5對Eos%和LTB4的影響

*vs CON，P<0.05

2.3鼻粘膜組織中mTOR、4EBP、eIf4E和H1F-1α的表達(dá)mTOR(圖1)、EIf4E(圖2)、4EBP(圖3)和H1F-1α(圖4)的陽性染色為棕黃色顆粒，表達(dá)于鼻粘膜上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞和血管周圍炎性細(xì)胞，胞漿與胞核均著色。對照組中少見蛋白陽性表達(dá)。與OVA 組相比，PM2.5與OVA 聯(lián)合處理后，大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞中mTOR、4EBP、EIF4E、HIF1α 表達(dá)明顯上調(diào)。

圖1PM2.5對大鼠鼻黏膜mTOR表達(dá)的影響 圖2PM2.5對大鼠鼻黏膜EIF4E表達(dá)的影響

3討論

變應(yīng)性鼻炎(AR)是以鼻腔粘膜Th2免疫反應(yīng)為主的慢性過敏性炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻腔激發(fā)刺激后，OVA組、PM2.5組和OVA+PM2.5組LTB4和外周血Eos%均明顯增高，以O(shè)VA+PM2.5組最為明顯。Eos%及LTB4是指導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的標(biāo)志[4，5]，這一結(jié)果提示，PM2.5能加重大鼠的AR癥狀。PM2.5進入鼻腔后，可由于其自身的物理刺激或表面所吸附的重金屬及有機物的毒性作用，損傷鼻黏膜上皮纖毛系統(tǒng)，破壞上皮屏障的完整性，降低黏膜的清除能力，使OVA更易在鼻腔蓄積，因此PM2.5與OVA聯(lián)合處理可加重炎癥反應(yīng)。

圖3PM2.5對大鼠鼻黏膜4EBP表達(dá)的影響 圖4PM2.5對大鼠鼻黏膜H1F1α表達(dá)的影響

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與上皮細(xì)胞炎癥及功能紊亂密切相關(guān)，mTOR可通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的代謝與功能[6]，參與過敏性氣道疾病[7，8]。TLR3可激活骨髓細(xì)胞的mTOR參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。Lorne E[10]等發(fā)現(xiàn)，mTORC1激活是TLR2誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化所必需的。Schmitz F[11]證明，TLR可通過PI3K-Akt途徑活化mTOR，進而調(diào)節(jié)干擾素的轉(zhuǎn)錄。

為了進一步探討PM2.5加重AR的機制，本研究檢測mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與OVA組相比，PM2.5與OVA 聯(lián)合處理后，大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞中mTOR、4EBP、eIF4E和H1F-1α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示PM2.5加重AR可能與mTOR信號通路有關(guān)。mTOR是一種保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶[12]，與炎癥調(diào)控[13]、細(xì)胞增殖和生存[14]密切相關(guān)。AR是特應(yīng)性個體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞是參與AR的主要細(xì)胞。mTOR可調(diào)控中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞功能，mTOR抑制劑可降低炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15]，并調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞及促炎細(xì)胞的平衡[16]。因此，由本研究結(jié)果推測，PM2.5加重AR的機制可能與mTOR信號通路激活相關(guān)，mTOR可能參與了鼻粘膜上皮細(xì)胞炎癥及功能紊亂。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金(21407148、41205108)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(JCKY-QKJC26)；吉林大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項目(2015741096)*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1055-04

中圖分類號：R392.2

文獻標(biāo)識碼：A

(收稿日期：2016-05-10)

Effect of PM2.5 on mTOR signaling pathway in OVA-induced allergic rhinitis of rats

HUANGXin-mei,HEPeng,HUANGLian-di,etal.

(NursingcollegeofJilinuniversity,Changchun130021 ,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of inhalable particle (PM2.5) on ovalbumin induced allergic rhinitis (AR) of rats and discuss its mechanism.MethodsForty female Wistar rats were randomly divided into four groups:control group,OVA control group,PM2.5 group and PM2.5 plus OVA group.The animal model of AR were basically allergized and provoked through nasal cavity by OVA.The percentage of eosinophils (Eos%) in peripheral blood was measured by automatic blood analysis; the levels of leukotriene B4 (LTB4) in serum and urinarynasal lavage fluid were measured by ELISA; the expression of mTOR signaling related protein were detected by immunohistochemical staining.ResultsAfter treated by PM2.5,the Eos% and the levels of LTB4 were increased,the expression of mTOR,4EBP,EIF4E and HIF1ɑin rat nasal epithelial cells were up-regulated. ConclusionPM2.5 regulate the inflammation of allergic rhinitis by activating mTOR signal pathway in rat nasal epithelial cells.

Key words:particulate matter (PM2.5); allergic rhinitis; mTOR signaling pathway