Wnt/β-catenin信號通路的激活及調控在不同中醫證型乳腺癌中的意義及機制

宮國良，陳靜寧，劉曉雨，張元鑫，林　騰

(1.汕頭潮南民生醫院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭市金平區婦幼保健院 婦產科，廣東 汕頭515044；3.汕頭大學醫學院第一附屬醫院)

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Wnt/β-catenin信號通路的激活及調控在不同中醫證型乳腺癌中的意義及機制

宮國良1，陳靜寧2，劉曉雨1，張元鑫1，林騰3*

(1.汕頭潮南民生醫院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭市金平區婦幼保健院 婦產科，廣東 汕頭515044；3.汕頭大學醫學院第一附屬醫院)

摘要：目的探討β-catenin、Slug、P-GSK3β在不同中醫證型乳腺癌中的表達，進而分析不同中醫證型乳腺癌Wnt/β-catenin信號通路激活及調控的意義及機制。方法對102例乳腺癌患者進行術前中醫辨證分型，術后行病理常規檢查，并進行β-catenin、Slug、P-GSK3β免疫組織化學染色。結果102例乳腺癌中肝郁痰凝型47例(46.08%)，沖任失調型36例(35.29%)，正虛毒熾型19例(18.63%)；不同中醫證型組β-catenin、Slug、P-GSK3β的表達存在差異性，組間比較具有統計學意義。結論Wnt/β-catenin信號通路的激活在不同中醫證型乳腺癌中存在差異，且該差異與Slug、P-GSK3β的調控相關。

關鍵詞：乳腺癌；中醫證型；免疫組織化學

(ChinJLabDiagn,2016,20:1076)

近年來，有關乳腺癌中醫證型與分子標志物的相關性研究越來越多，研究者從各自的研究角度出發選用不同的指標進行分析，研究結果均認為乳腺癌的中醫證型與分子標記物間存在一定相關性。通過文獻復習可以發現，大多數學者把研究重點集中在乳腺癌中醫證型與預后的相關性上，而對其進一步的分子機制，國內外均未見相關報道，因此我們選擇與乳腺癌較為密切的Wnt/β-catenin信號通路與中醫證型的相關性進行分析，通過對該信號通路相關蛋白β-catenin及其調控蛋白鋅指轉錄因子(Slug)和磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(P-GSK3β)的研究，進一步闡明不同中醫證型乳腺癌的可能分子機制，為中醫證型與現代醫學的緊密結合提供可行的依據。

1材料與方法

1.1材料收集汕頭潮南民生醫院2013年3月-2015年12月診斷的乳腺癌病例102例，患者年齡25-81歲，平均53±28歲，所有患者均進行術前中醫辨證分型及術后病理檢查。中醫辨證分型分為三組，其中肝郁痰凝型47例，沖任失調型36例，正虛毒熾型19例。術后病理分型顯示，浸潤性導管癌91例，浸潤性小葉癌6例，髓樣癌4例，粘液癌1例。

1.2方法標本經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規石蠟包埋、切片及染色。免疫組化采用EnVision兩步法，β-catenin單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司，Slug、P-GSK3β多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。組織切片65℃烤片后脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗，PBS沖洗5 min×3，滴加—抗室溫孵育1.5h，PBS沖洗5 min×3，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3，DAB顯色，鏡下控制陽性細胞呈棕色為止，充分蒸餾水洗，蘇木素復染1分鐘，脫水，封片。免疫組化均設陽性對照及陰性對照。β-catenin正常表達于細胞膜，出現細胞漿和/或細胞核的陽性為異常表達，Slug主要表達于細胞漿、P-GSK3β表達于細胞膜和細胞漿。

1.3統計學方法采用IBM SPSS Statistics18.0軟件，多組間比較采用方差分析；β-catenin、Slug、P-GSK3β相關性分析采用Spearman等級相關分析；以α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1102例乳腺癌中醫辨證分型參考國家中醫藥管理局頒布的《中醫病癥診斷療效標準》(ZY/T001.2-94)及相關文獻[1]，將乳腺癌患者分為3個證型組：其中肝凝痰凝型47例(46.08%)、沖任失調

型36例(35.29%)、正虛毒熾型19例(18.63%)。

2.2β-catenin在乳腺癌各中醫證型中的表達情況β-catenin只有細胞漿和/或細胞核的異常表達，才定義為陽性，只出現細胞膜的著色，定義為陰性。β-catenin在3組中醫證型組間存在差異性表達，具有統計學意義，P<0.05，見表1，圖1。

2.3Slug在乳腺癌各中醫證型中的表達情況Slug主要表達于細胞漿，在正虛毒熾型中表達陽性率最高，與其他兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，肝郁痰凝型與沖任失調型表達率較低，且組間比較無統計學意義，見表1，圖2。

2.4P-GSK3β在乳腺癌各中醫證型中的表達情況P-GSK3β表達于細胞膜及細胞漿，在肝郁痰凝組中的陽性表達率明顯低于其他兩組，差異具有統計學意義(P<0.05)，沖任失調組與正虛毒熾組表達率較高，兩組間比較，差異無統計學意義，見表1，圖3。

表1　β-catenin、Slug、P-GSK3β在乳腺癌各中醫證型中的表達情況

圖1沖任失調型型乳腺癌，β-catenin出現細胞漿的異常表達 EnVision法 高倍放大。圖2肝郁痰凝型乳腺癌，Slug細胞漿陽性表達 EnVision法 高倍放大。圖3正虛毒熾型型乳腺癌，P-GSK3β細胞膜及細胞漿陽性表達 EnVision法 高倍放大

2.5不同中醫證型乳腺癌β-catenin、Slug、P-GSK3β表達的相關性β-catenin與 P-GSK3β在3種中醫證型乳腺癌中呈明顯的正相關(r值分別為0.166、0.255、0.221，P值分別為0.025、0.007、0.014)，β-catenin與Slug在沖任失調型和正虛毒熾型中呈負相關(r值分別為-0.174、-0.322，P值分別為0.011、0.003)，在肝郁痰凝型中無明顯的相關性(r=0.054,P=0.748)。在3組中醫證型中Slug與P-GSK3β均無明顯相關性，由此也可以看出，兩者對Wnt/β-catenin信號通路的調控是通過不同的機制完成的。

3討論

有關乳腺癌中醫證型與分子標志物的相關性研究，國內有較多報道[2-6]，但重點多集中在乳腺癌中醫證型與預后或指導治療的分子標志物相關性上，而對其進一步的機制少有研究。在乳腺癌的發病機制中，Wnt/β-catenin信號通路的激活與調控是得到證實的關鍵理論點[7-9]。β連環蛋白(β-catenin)是一種胞內蛋白，定位于人染色體3p21.3，其mRNA長度為3362個核苷酸殘基，相對分子質量為90 ku。β-catenin具有雙重功能：一是介導細胞E-鈣黏連素(E-cadherin)的重要結構分子，其異常改變在腫瘤侵襲、轉移中具有重要作用；二是作為Wnt信號通路的關鍵信號分子，與腫瘤發生密切相關[10]。Wnt信號通路的多個成員都參與了乳腺癌的發生、發展， Wnt信號通路的核心是胞質內β-catenin的穩定性，在正常乳腺中β-catenin呈膜陽性表達，當出現胞漿/核異常表達時Wnt信號通路開放，而乳腺癌發生的一個重要因素就是Wnt信號通路被異常激活，大量的國內外研究都證實了這一理論。通過我們的研究可以發現，不同中醫證型乳腺癌中均存在β-catenin的異常表達，但以正虛毒熾型異常表達率最高，說明不同中醫證型乳腺癌中Wnt/β-catenin信號通路激活存在差異，對于該差異的機制，筆者認為與鋅指轉錄因子(Slug)和磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(P-GSK3β)的調控有關。

Slug是E-cadherin 啟動子的抑制子，能夠特異抑制黏附連接成分(E-cadherin和β-catenin)，從而發揮對Wnt信號通路的調節作用[11，12]。本組實驗發現，在乳腺癌不同中醫證型中，Slug蛋白在正虛毒熾型組中的表達水平明顯其他兩組組，相關性分析顯示β-catenin與Slug在沖任失調型和正虛毒熾型中呈負相關，在肝郁痰凝型組中，兩者無明顯的相關性，這些均提示Slug參與了Wnt/β-catenin信號通路的調控，但僅是Wnt/β-catenin信號通路調控機制之一，該信號通路的調控應該是復雜的、多因素的。 GSK-3β是一個多功能的絲氨酸蘇氨酸類激酶，在真核生物中普遍存在，其基因定位于人染色體3q13.3。GSK-3β是絲氨酸/氨酸激酶，通過降解β-catenin 發揮抑制腫瘤生長的作用，由于GSK-3β的活性由不同位點的磷酸化狀態調節，GSK-3β發生磷酸化可降低GSK-3β活性，磷酸化后GSK-3β( P-GSK3β)可以防止GSK-3β與β-catenin及細胞周期素D1(CyclinD1)結合，使β-catenin和CyclinD1 發生過度表達，cycinD1 可與 CDK4 /6在G1期結合形成復合物，促進細胞G1/S期轉換，細胞從G1期進入S期，過度增殖，最后惡性轉化，發生乳腺癌。目前，研究認為P-GSK3β是β-catenin的主要正調控因子，可以使變異的β-catenin 蛋白積累并進細胞質和細胞核，參與并與轉錄因子結合，啟動轉錄過程，引發了細胞循環周期失控，加快了腫瘤增殖[13，14]。通過我們的研究可以發現，在乳腺癌不同中醫證型中，P-GSK3β的表達存在差異性，在肝郁痰凝組中表達率最低，與其他兩組比較，差異具有統計學意義，沖任失調組與正虛毒熾組表達率較高，兩組間比較，差異無統計學意義。相關性分析顯示，β-catenin與P-GSK3β呈明顯正相關，這與文獻報道較一致。

綜上所述，不同中醫證型乳腺癌存在β-catenin的異常表達，且表達具有差異性，說明Wnt/β-catenin信號通路的激活情況在不同中醫證型的乳腺癌中存在差異，此種差異與Slug 及P-GSK3βGSK的調控作用密切相關。

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基金項目：廣東省中醫藥局建設中醫藥強省科研資助項目 粵中醫〔2014〕25號

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1076-04

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

(收稿日期：2016-02-24)

The significance and mechanism of activation and regulation of wnt/β-catenin signal pathway in breast cancers with different TCM syndromes

GONGGuo-liang,CHENJing-ning,LIUXiao-yu,etal.

(Departmentofpathology,ChaonanMinshengHospitalofShantou,Shantou515044，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of β-catenin,Slug and P-GSK3β in breast cancers with different Traditional Chinese Medicine(TCM) syndromes,and further anlyze the significance and mechanism of activation and regulation of wnt/β-catenin signal pathway in breast cancers with different TCM syndromes.MethodsPreoperative TCM syndrome differentiation was carried out on 102 patients with breast cancer,.Routine pathological examination was performed postoperatively,and immunohistochemical staining was conducted for β-catenin,slug and P-GSK3β.ResultsAmong the 102 patients with breast cancer,47 patients(46.08%) had liver-qi stagnation and phlegm stagnation type,36(35.29%) had Chong and Ren disorders,and 19(18.63%) had is the deficiency of heat toxin type.Moreover,the expression of β-catenin,slug and P-GSK3β among different TCM syndrome groups demonstrated differeces,which showed statistical significance.ConclusionThe activation of wnt/β-catenin signal pathway has different effects on breast cancers with different TCM syndromes,which are associated with the regulation of β-catenin,slug and P-GSK3β.

Key words:Breast cancer;Traditional Chinese Medicine syndrome;Immunohistochemistry