微小RNA-146a上調cyclin D1表達誘導大鼠血管平滑肌細胞的增殖①

熊　瑋　駱　瑜　董少紅　李江華　廖碧紅　龐新利　羅林杰

(暨南大學第二臨床醫學院/深圳市人民醫院心內科,深圳518020)

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微小RNA-146a上調cyclin D1表達誘導大鼠血管平滑肌細胞的增殖①

熊瑋駱瑜董少紅李江華廖碧紅龐新利羅林杰

(暨南大學第二臨床醫學院/深圳市人民醫院心內科,深圳518020)

[摘要]目的：采用基因芯片技術研究小分子RNA-146a(miR-146a)促進血管平滑肌細胞增殖的作用靶點并進行驗證。方法：原代培養大鼠血管平滑肌細胞，分成mimics組、inhibitor組、control組、sham組，分別體外轉染miR-146a mimics(50 nmol/L)、miR-146a inhibitor(50 nmol/L)、miR-146a錯義鏈(50 nmol/L)、PBS，Real time PCR測定轉染后miR-146a水平，CCK8法檢測轉染后血管平滑肌細胞增殖情況。采用基因芯片檢測inhibitor組和control組基因表達譜，通過生物信息學技術篩選出差異基因和調控的信號通路。對篩選出來的信號通路用Real time PCR和Western blot進行驗證。結果：轉染48 h后，inhibitor組血管平滑肌細胞的miR-146a水平明顯低于control組和sham組(P<0.01)，inhibitor組血管平滑肌細胞的OD值明顯低于control組、sham組(P<0.05)。通過對基因表達譜分析發現，p53信號通路被miR-146a上調。用Real time PCR和Western blot進行檢測發現，p53信號通路中關鍵分子p53、caspase3、PTEN的mRNA和蛋白水平無明顯變化(P>0.05)，而mimics組VSMC中cyclin D1的mRNA和蛋白水平增加(與sham相比，P<0.05)，inhibitor組VSMC中cyclin D1的mRNA和蛋白水平下降(與sham相比，P<0.05)。 結論：miR-146a可能通過上調細胞周期蛋白cyclin D1的表達促進大鼠血管平滑肌細胞的增殖。

[關鍵詞]血管平滑肌細胞；miR-146a；基因譜；P53；cyclin D1

小分子RNA-146a(microRNA-146a,miR-146a)是第一個被發現在免疫系統中具有調節作用的小RNA，主要與類風濕性關節炎、腫瘤、膿毒血癥等疾病的發生相關[1]。近年來的研究發現，急性冠脈綜合征患者外周血單個核細胞中miR-146a的水平顯著升高，miR-146a能促進Th1細胞的分化，上調Th1細胞的功能，可能參與了對冠心病患者的免疫功能調節[2]。在頸動脈球囊損傷后頸動脈組織中miR-146a的表達水平顯著上調，miR-146a可能參與了球囊損傷后再狹窄的病理[3]。最近的研究還發現，miR-146a參與了ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發生[4]。這些研究都表明miR-146a與動脈粥樣硬化、冠心病和再狹窄的發生具有相關性，但它在這些疾病中的具體作用并不清楚。

在前期研究中，我們發現在血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖過程中，miR-146a水平顯著上調，miR-146a可以促進VSMC的增殖和遷移，抑制其凋亡，但具體機制不清楚[5-7]。本文擬通過基因芯片技術和信息學分析，探尋miR-146a促進VSMC增殖的作用靶點和信號通路。

1材料與方法

1.1試劑與材料SPF級SD大鼠購自廣東省實驗動物中心，DMEM培養基、0.25%胰酶、FBS購自Gibco公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，RNeasy Mini Kit試劑盒購自Qiagen公司，All-in-one miRNA qRT-PCR detection kit購自genecopoeia公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自TaKaRa公司，CCK8試劑盒購自同仁化學研究所，大鼠alpha-actin抗體購自博士德公司，大鼠miR-146a mimics、抑制子及陰性對照由吉瑪公司合成，miR-146a、p53、caspase3、PTEN、cyclin D1、U6引物由生工公司合成，p53、caspase3、PTEN、cyclin D1抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1大鼠VSMC培養及miR-146a干擾按照本室建立的方法培養VSMC及進行miR-146a干擾[5-7]。實驗分為4組，高表達組(mimics)、抑制組(inhibitor)、陰性對照組(control)及正常VSMC組(sham)，其中miR-146a抑制子進行6-FAM熒光標記。分別轉染miR-146a mimics(50 nmol/L)、miR-146a抑制子(50 nmol/L)、miR-146a錯義鏈(50 nmol/L)，sham組加入同等劑量PBS，5 h后換成完全培養基，熒光顯微鏡觀察轉染效率。

1.2.2熒光定量PCR轉染48 h后按照試劑盒指南操作，提取RNA逆轉錄成cDNA，并進行PCR反應。引物序列為：miR-146a上游引物(5′-3′)TGAGAACTGAATTCCATGGGTT，miR-146a下游引物為通用引物，U6上游引物(5′-3′)CTCGCTTCGGCAGCACA，U6下游引物(5′-3′)ACGCTTCACGAATTTGCGT，miR-146a與U6相對表達量用公式2-ΔΔCT計算。

1.2.3VSMC增殖細胞處理后以每孔104個細胞接種至96孔板，每組設6個復孔，24 h后進行轉染，5 h后換為100 μl完全培養基，培養48 h后加入10 μl WST試劑染色，在37℃、5%CO2培養2 h，在酶聯免疫檢測儀下測定450 nm(參考波長650 nm)的OD值。

1.2.4表達譜芯片檢測實驗分成miR-146a抑制組及對照組，每組3個樣品，共6張芯片。具體檢測方法為轉染miR-146a inhibitor及control，48 h后吸出培養液，加入1～2 ml Trizol，-70℃保存送上海康成生物公司進行芯片檢測：樣品用Agilent ND1000檢測RNA是否降解及RNA濃度，用Agilent Quick Amp Labeling對樣品進行標記，Agilent Surehyb進行雜交，用Agilent DNA Microarray Scanner進行掃描，用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)采集芯片信號，用Agilent GeneSpring GX 12.1對原始數據進行Quantile標準化和數據處理，兩組樣品間具有統計學意義的差異表達基因通過火山圖篩選和Fold Change篩選，使用標準的富集計算方法進行GO分析和Pathway分析。

1.2.5實時PCR和Western 印跡分析將大鼠VSMC分成4組：sham、control、inhibitor及mimics，轉染48 h提取RNA，逆轉錄成cDNA，按照試劑盒方法進行PCR反應，檢測p53信號通路關鍵基因p53、caspase3、PTEN、cyclin D1的mRNA。

轉染48 h后提取總蛋白質，每孔加入20 μl蛋白質溶液，在10%的SDS-PAGE中80 V、30 min及120 V、1 h進行電泳分離，半干轉液38 mA、90 min轉入PVDF膜，5%牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠p53一抗(1∶200)、caspase3一抗(1∶1 000)、PTEN一抗(1∶1 000)、cyclin D1一抗(1∶1 000)及GAPDH一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，1‰TBST洗10 min 3次，加入羊抗兔二抗(1∶6 000)孵育1 h，1‰TBST洗10 min 3次，加入ECL發光液100 μl在Image Quant RT ECL冷CCD成像系統進行顯影，用Imagequant TL軟件進行半定量分析。

2結果

2.1miR-146a促進VSMC增殖轉染miR-146a 抑制子 5 h用熒光顯微鏡觀察，在VSMC胞漿內可見大量顆粒狀熒光，表明miR-146a inhibitor已進入VSMC內(見圖1)。用實時PCR檢測3組細胞之間的miR-146a水平，與sham組和對照組相比，抑制子組的miR-146a mRNA相對表達水平顯著下降，差異具有顯著性(P<0.01)，sham組和control組相比miR-146a水平無明顯差異(P>0.05)，表明RNA干擾成功(見圖2A)。采用CCK8檢測干擾48 h時VSMC的增殖情況，sham組和control組OD值無明顯差異(P>0.05)，inhibitor組的OD值明顯下降(P<0.05)，表明miR-146a inhibitor抑制了VSMC的增殖(見圖2B)。

圖1　熒光顯微鏡檢測血管平滑肌細胞內miR-146a抑制劑轉染效率Fig.1　miR-146a inhibitors labeled by 6-FAM fluorescence in VSMCs were detected by fluorescence microscope

圖2　miR-146a促進血管平滑肌細胞增殖Fig.2　miR-146a promoted proliferation of VSMCsNote: A.Relative expression of miR-146a(Real time PCR);B.VSMCs proliferation(CCK8).Contrast with Sham,Δ.P<0.01,*.P<0.05.

2.2p53信號通路是miR-146a的作用靶點用實時 PCR檢測inhibitor和control組之間的miR-146a相對水平，inhibitor組顯著低于control組(P<0.01)(見圖3)。在總共16 802個基因中，8 547個基因表達上調，占50.8%，8 255個基因表達下降，占49.2%.以變化倍數>2.0為截斷點，有806個基因上調，其中7個基因變化倍數>10.0(見表1)；在下調基因中有1 026個基因變化倍數>2.0，有9個基因變化倍數>10.0(見表2)。KEGG通路分析顯示P53信號通路被miR-146a上調。

2.3miR-146a上調cyclin D1表達Real time PCR結果顯示，各組VSMC之間p53、caspase3、PTEN的mRNA水平無明顯改變(P>0.05)，而mimics組VSMC中的cyclin D1 mRNA上調(sham vs mimics，P<0.001)，inhibitor組cyclin D1 mRNA水平下降(sham vs inhibitor，P<0.01)，sham與control組VSMC的cyclin D1相比無明顯差異(P>0.05)(見圖4A)。

Western印跡結果顯示，各組VSMC的p53、 caspase3、 PTEN蛋白的水平無明顯變化， 而 mimics

圖3　熒光定量PCR檢測miR-146a mRNA的相對水平Fig.3　Relative expression of miR-146a explored by real time PCRNote: Contrast with Control,*.P<0.01.

表1miR-146a上調且Fold change>10.0的基因

Tab.1Genes raised by miR-146a(Fold change>10.0)

GenesymbolGenbankaccessionFoldchangeP-valueFDRRegulationDdx60XM_00625306023.46518610.0006277180.007357081upNkx6-1NM_03173714.70960570.0191168130.051872179upBrinp3NM_17312113.07642470.0001254620.00347545upPlcd1NM_01703512.49469320.0004579920.006324951upPtpn5NM_01925312.36949960.0085046740.030104898upParp9NM_00110335111.18903980.0023357910.013887582upPrkg2NM_01301210.8583110.0014909770.010976278upDdx58NM_0011066459.17563010.0002059920.004289575up

表2miR-146a下調且Fold change>10.0的基因

Tab.2Genes decreased by miR-146a(Fold change>10.0)

GenesymbolGenbankaccessionFoldchangeP-valueFDRRegulationTbc1d31NM_00113484216.96458930.0013576080.010500376downCrabp1NM_00110571615.35712270.0006196420.007298685downSlfn3NM_05368713.31673960.0058545420.023927947downDchs1NM_00110754412.06812520.0002816760.004978058downLOC102555503XR_36076311.85774220.0314077960.073162969downSpdyaNM_13885511.52859130.0002543630.004785786downDlgap5NM_00113580210.63689990.0007633780.008067516downCse1lNM_00110860710.33489480.0008177590.008380534downTmem108XM_00622654310.2315780.0001090740.003233177down

圖4　miR-146a上調cyclin D1的表達水平Fig.4　miR-146a up-regulated the expression of cyclin D1Note: A.Relative expression of cyclin D1(Real time PCR)，contrast with Sham,#.P<0.001,*.P<0.01；B.Protein expression of p53,caspase3,PTEN,cyclin D1(Western blot).

組VSMC中的cyclin D1表達上調(sham vs mimics，P<0.05)，inhibitor組cyclin D1表達下降(sham vs inhibitor，P<0.05)，sham與control組VSMC的cyclin D1相比無明顯差異(P>0.05)(見圖4B)。

3討論

小分子RNA作為一個廣泛分布的重要的基因調節子，在機體的正常生長、發育、分化、信號轉導、疾病和死亡等生理和病理過程均發揮重要作用。近年來的研究表明，miRNA不僅可以作為疾病的生物學診斷標志用于疾病的診斷，還可以作為基因藥物用于疾病的治療[8,9]。

miR-146a被認為是調節免疫功能的主要miRNA之一[10]。研究發現，用脂多糖刺激單核細胞，可以誘導miR-146a表達增加，用腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和白細胞介素-1β(Interleukin-1,IL-1β)也能夠通過核因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)依賴的途徑促進miR-146a的表達。miR-146a通過下調TNF受體相關因子6和白介素1受體相關激酶1的水平，負調控炎癥和免疫反應，避免過度炎癥反應的發生[11，12]。在類風濕性關節炎、腫瘤、膿毒血癥等疾病的研究中也證實了miR-146a在疾病發生發展中的重要作用，可以作為某些疾病的生物學標志[13-15]。Guo等[2]發現急性冠脈綜合征患者外周血單個核細胞中miR-146a的水平顯著升高，并能上調Th1細胞的功能，給予miR-146a可以促進Th1細胞的分化和NF-κBp65的合成，表明miRNA-146a可能與冠心病患者的免疫功能調節有關。也有學者發現，在球囊損傷再狹窄的動物模型中miR-146a的表達水平顯著上調[3]，可能參與了動脈粥樣硬化和球囊損傷后再狹窄的發生發展過程。載脂蛋白E(ApoE)是調節脂質代謝的重要蛋白，對動脈粥樣硬化發揮負調控作用。最近的研究發現，在單核細胞和巨噬細胞中ApoE通過促進miR-146a表達，抑制NF-κB，抑制炎癥和動脈粥樣硬化的發生[4]。在急性ST抬高型心肌梗死的患者中循環miR-146a有助于預測心室重構的發生[16]。這些研究表明miR-146a與動脈粥樣硬化、冠心病、再狹窄等疾病存在密切關聯，但研究結果存在不一致。如Guo等[2]發現miR-146a促進Th1細胞合成NF-κB，而在巨噬細胞和單核細胞中miR-146a抑制NF-κB表達[4]。

我們在前期研究中發現，在血管平滑肌細胞增殖過程中miR-146a水平顯著上調；用RNA干擾的方法抑制VSMC中miR-146a表達后，VSMC增殖和遷移明顯減少，凋亡增加，但具體機制不清楚[5-7]。雙熒光素酶報告基因檢測是研究miRNA的目的基因的經典方法，但該方法對信號通路的研究缺乏系統性。在本文中，我們采用了基因表達譜芯片來篩選miR-146a發生作用所依賴的靶點和信號通路，檢測結果和生物信息學分析顯示p53信號通路被miR-146a inhibitor激活。進一步研究發現，p53信號通路中的關鍵分子cyclin D1的基因和蛋白水平均被miR-146a上調。

細胞周期蛋白(cyclin)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CKD)的復合物(cyclin/CDKs)在細胞從G1期向S期轉化的過程中發揮重要調控作用，其中最關鍵的調控蛋白為cyclin D1/CDK4[17]。多個研究都發現cyclin D1活化與血管平滑肌細胞的增殖和血管內膜的重構密切相關，是介導血管平滑肌細胞增殖的重要作用靶點[18-20]。在本文中，我們發現miR-146a可能是通過上調cyclin D1的表達促進了血管平滑肌細胞的增殖。

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[收稿2015-10-15修回2016-01-13]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.009

作者簡介：熊瑋(1975年-)，男，博士，副主任醫師，主要從事冠心病的基礎研究，E-mail:xw0926@126.com。

中圖分類號R544.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0974-05

MicroRNA-146a promotes proliferation of rat vascular smooth muscle cells by up-regulating cyclin D1 expression

XIONG Wei,LUO Yu,DONG Shao-Hong,LI Jiang-Hua,LIAO Bi-Hong,PANG Xin-Li,LUO Lin-Jie.

Department of Cardiology，the Second Clinical Medical College of Ji′nan University,Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen 518020,China

[Abstract]Objective:To detect and verifica the gene profile difference of microRNA-146a (miR-146a) and its role in the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) by gene chip technology.Methods: Artificially synthesized miR-146a mimics(50 nmol/L),miR-146 inhibitor(50 nmol/L),scramble(50 nmol/L) and PBS were transfected into cultured primary rat VSMCs in vitro.After transfection,Real time PCR was used to measure the levels of miR-146a and the cell counting kit 8(CCK8) was employed to investigate the proliferation of VSMCs.The VSMCs interfered by miR-146a inhibitor or miR-146a control were examined by gene chips and the profile of gene were analyzed by bioinformatics technology to detect the different genes and signal transduction pathway.The changes in mRNAs and proteins were accessed separately by Real time PCR and Western blot.Results: Compared with sham and control VSMCs,miR-146a expression level was significantly decreased in treatment with miR-146a inhibitor(P<0.01),as well as optical density(OD) was also shown remarkably down regulated simultaneously(P<0.05).The investigation of gene profile revealed that the p53 signal pathway was up-regulated in VSMCs interfered by miR-146a.The mRNA and protein expression levels of p53,caspase3 and PTEN in p53 signal transduction pathway didn′t show significant differences(P>0.05),however,the mRNA and protein expression levels of cyclin D1 significantly increased in treatment with miR-146a mimics VSMCs group and decreased in miR-146a inhibitor VSMCs group(compared with sham VSMCs group,both P<0.05).Conclusion: Our data indicated that miR-146a may promote the proliferation of rat VSMCs by up-regulating cyclin D1 expression.

[Key words]Vascular smooth muscle cell;miRNA-146a;Gene profile; p53;cyclin D1

①本文為深圳市衛計委資助課題(No.201505001)。