淫羊藿苷對高糖培養條件下大鼠頜骨骨髓基質細胞成骨能力的影響

李春梅，王馨，周立群，康立勛，李海清，馬晟利.黑龍江省醫院口腔科，黑龍江哈爾濱　5000；.黑龍江省醫院產科，黑龍江哈爾濱　5000

淫羊藿苷對高糖培養條件下大鼠頜骨骨髓基質細胞成骨能力的影響

李春梅1，王馨1，周立群2，康立勛1，李海清1，馬晟利1
1.黑龍江省醫院口腔科，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江省醫院產科，黑龍江哈爾濱150001

目的探討淫羊藿苷對高糖培養條件下大鼠頜骨骨髓基質細胞成骨能力的影響。方法選取2015年6月—2016年4月黑龍江省醫院實驗室的8只大鼠，實驗分組（每個基因進行5個復孔平行實驗）:正常組（2%胎牛血清+DMEM培養的細胞），高糖組（2%胎牛血清+高糖-DMEM培養的細胞），淫羊藿苷組1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養的細胞），淫羊藿苷組2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養的細胞），每組進行5個復孔平行實驗。熒光定量測定成骨相關基因BMP2、OPN、BSP基因的表達。結果淫羊藿苷組1（1.78±0.10）與其它組比較:BMP2（1.37±0.04）、OPN（1.38±0.09）、BSP（1.50±0.05）基因的表達均高于其相應的對照組（P＜0.05）。結論淫羊藿苷對高糖培養條件下大鼠頜骨骨髓基質細胞成骨能力有加強作用。

淫羊藿苷；高糖；骨髓基質細胞

［Abstract］Objective To investigate the effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells induced by high glucose in rats under high concentration of glucose.Methods Selected June 2015-2016 in April in Heilongjiang Province Hospital Laboratory of 8 rats，experimental groups（each gene of five hole complex parallel experiment）∶normal group（2%FBS DMEM culture cells），high glucose group（2%fetal bovine serum+glucose of both cultured cells），icariin group 1（2%fetal bovine serum DMEM+icariin cultured cells）and icariin group 2（2%fetal bovine serum and high glucose increased+icariin cultured cells），every five holes in parallel experiments.The expression of BMP2，OPN and BSP genes in the bone related genes was determined by fluorescence quantitative.Results Compared with other groups，the expression of BMP2（1.37±0.04），OPN（1.38±0.09）and BSP（1.50±0.05）genes in the group of 1（1.78±0.10）and other groups was higher than that in the control group（P＜0.05）.Conclusion The effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells of rats under high glucose condition was enhanced by the high concentration of glucose in the rat bone marrow stromal cells.

［Key words］Icariin；High glucose；Bone marrow stromal cells

當人類社會日益發展并逐漸趨向老齡化時，人類患糖尿病的幾率也日漸呈上升趨勢，而該疾病會導致多種并發癥，進而對患者健康造成極大影響。在由糖尿病引發的各種并發癥中，骨質疏松是其較為常見的，且屬于一種慢性疾病，因此會讓患者長時間承受病痛，也會造成相關的功能障礙，而且還有致殘的可能，且幾率要比其它很多相關疾病都高［1］。糖尿病引起的骨質疏松近年來日益受到醫學界的重視。淫羊藿苷（Herba epimedii）是一種傳統的補益中藥，其性味辛、甘、溫。體現出強筋骨，補腎陽，祛風濕等各方面的作用。在臨床上被廣泛用于骨折、骨代謝相關的多種疾病的治療中，已取得了顯著的療效［2］。骨形成蛋白2 （BMP2）在骨骼系統的早期發育過程中有著廣泛的參與，無論是牙胚、心腦等關鍵臟器的形成，還是附件骨等的發育，都有著起到了重要的影響作用［3］。對成骨細胞的黏附過程和礦化的結束過程起著重要作用的就是骨橋蛋白（OPN）。骨涎蛋白（BSP）在骨礦化中扮演重要的角色，這主要是由它的時空特點體現的，因為它的表達主要在礦化組織［4］。

該課題通過探討淫羊藿苷在高糖培養環境下，于2015年6月—2016年4月在黑龍江省醫院實驗室8只大鼠頜骨骨髓基質細胞成骨能力的影響，為淫羊藿苷治療糖尿病引起的骨病提供理論基礎并開辟新的思路。

1　實驗材料與方法

1.1材料及設備

1.1.1材料 取100 g左右3個月健康雄性SD大鼠（黑龍江省醫院動物飼養室提供）8只，頸椎脫臼處死。傳三代培養，獲得頜骨骨髓基質細胞［4］。

1.1.2試劑Super M-MLV反轉錄酶（20151221，0.5 mmol/L，武漢），高純總RNA快速提取試劑盒（2015 1221，0.5 mmol/L，武漢），RNase固相清除劑（20152123，0.01mmol/L，武漢）Powder瓊脂糖（20154211，0.6mmol/L，武漢）50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix（201519876，0.5 mmol/L，武漢）。

1.1.3儀器超速冷凍離心機（湖南湘儀，K1000），微量移液器（BIOHIT，s120），真空干燥箱（SYSBERY，100），紫外分光光度計（Thermo，p900），熒光定量PCR儀（BION EER，TR232）

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組正常組（2%胎牛血清+DMEM培養的細胞），高糖組（2%胎牛血清+高糖-DMEM培養的細胞），淫羊藿苷組1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養的細胞），淫羊藿苷組2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養的細胞）每組進行5個復孔平行實驗。

1.2.2總RNA提取 反轉錄得到cDNA。

1.2.3實時熒光定量分析 反應體系如下。

cDNA模板1 μL

上下游引物（10 μM）各0.5 μL

SYBR GREEN mastermix10 μL

用ddH2O補足至20 μL

反應條件如下。

該實驗利用韓國BIONEER公司生產的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。

1.2.4分析方法 RNA提取:按照實驗方法中的步驟進行RNA提取，并利用紫外分光光度計對提取的RNA濃度進行測定。RNA濃度見樣本信息表。實時熒光定量分析如下。

①分析方法∶本實驗分析方法利用2-△△CT方法。

②結果∶熒光定量分析儀得到的數據見附表（本實驗每種樣本每個基因進行5個復孔平行實驗，實驗數據的選取，是舍去誤差較大的數值，取剩余數值的平均值作為最終實驗保留數據）。利用2-△△CT方法分析數據見附表。

③統計分析方法:選用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。采取的數值格式為（Mean±SD），以正常組為參照組數值為1，以上數據統計均經SPSS 13.0軟件統計完成，采取3次獨立實驗的單因素方差分析（*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.001）。

2　結果

2.1熒光定量檢測實驗測定結果

BMP2熒光定量結果見圖1，OPN熒光宣結果見圖2，BSP熒光宣結果見圖3。

圖1　BMP2熒光定量結果

圖2　OPN熒光定量結果

圖3　BSP熒光定量結果

熒光定量結果顯示，淫羊藿苷組1BMP2、OPN和BSP基因表達明顯高于其它組，淫羊藿苷組2基因表達高于高糖組和正常組，說明，淫羊藿苷增強高糖環境下頜骨BMCs的成骨能力。

3　討論

糖尿病可引發骨代謝異常，進而導致多種糖尿病骨病（比如，骨量下降、骨折率上升等）。如上文所述，口腔骨丟失會對患者產生兩種重要影響，其一為牙齒存留，其二為義齒修復。此外，糖尿病可引發牙槽骨喪失，還會導致粘膜損傷，所以患者往往都對修復治療無法忍受［5］。當糖尿病患者人數逐漸上升，而相關醫療水平也日益提升時，糖尿病治療亦日趨復雜化。近年來的相關研究表明，糖尿病與牙周病二者之間存在一種雙向調節關系。根據大量科學數據可知，當人發生急性感染后，其內分泌狀態以及其代謝狀態都會發生變化，因此血糖控制很差，所以牙周感染會對糖尿病患者造成影響，使其無法很好地控制血糖［6］。有鑒于此，糖尿病治療應注重牙周病的防治，否則可增加治療難度。但在現實生活中，口腔醫生對于糖尿病所引發的口腔并發癥往往是較為忽視的。此外，對于糖尿病患者而言，維護口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科醫生不能充分重視這一點，那么口腔健康也無法得到保障［7］。不過，對糖尿病患者口腔疾病的診療維護需要有足夠的糖尿病知識作后盾，而口腔科醫生在這方面最為欠缺，這些都是亟待解決的。

淫羊藿苷是中醫治療骨質疏松癥最常用的藥物之一，大量臨床治療證明了該藥物的效果。作為淫羊藿的精華部分，淫羊藿苷在近年來被廣泛的應用于成骨、破骨細胞的干預研究中［8］。現有的研究成果顯示，淫羊藿苷在臨床應用過程中能夠有效的促進成骨細胞的發育和增殖。淫羊藿是一種藥用植物，可歸入小檗科淫羊藿屬的范疇，是我國醫學常用的傳統補益中藥［9］。根據《本草綱目》可知，這一味中藥有多種功效，比如祛濕補腎、強心益精、強筋健骨，等等。在臨床上，這味中藥常用于骨折治療，以及多種骨代謝相關疾病的治療，且具有很不錯的療效。通過相關研究結果可知，這味中藥具有諸多藥理活性，包括提高免疫力、抑制癌癥細胞、調節內分泌、提高性腺功能、延緩機體衰老進程、以及對心血管系統產生有益影響等等。這味中藥之所以具有如此重要的藥用價值，都歸功于其有效活性成分，也就是一種黃酮類化合物——淫羊藿苷。這種物質是一種結晶粉末，外觀呈淡黃色針狀，很難在水中溶解，但卻能在乙醇中溶解，也能在乙酸乙酯中溶解［10］。

該實驗研究表明，高糖可以導致大鼠BMCs成骨相關基因表達下降（包括BMP2，BSP，OPN）由于成骨相關基因表達和ALP活性是成骨細胞早期分化標記，細胞鈣結節形成是成骨細胞晚期分化標記，所有實驗結果說明高糖抑制了BMCs向成骨細胞的早期和晚期分化，當在高糖環境下加入淫羊藿苷后，相關基因表達增強（包括BMP2，BSP，OPN），與馬曉妮等人對成骨細胞的分化研究結果一致［11］。

BMP2，OPN，BSP和Runx2作為成骨能力評定指標，一般在BMCs向成骨細胞分化的過程中，伴隨著全部或者部分的表達升高［12］。通常的研究會選取以上的幾個指標作為判定細胞成骨能力及是否向BMCs分化的指標。該實驗選取了以上這些成骨相關基因，通過熒光定量的方法檢測，淫羊藿苷組1的BMP2，OPN，BSP和Runx2的表達均明顯高于其它組，淫羊藿苷組2基因表達高于高糖組和正常組，說明，淫羊藿苷能增強高糖環境下BMCs的成骨能力，這與謝曉偉等人研究的干細胞的成骨分化結果一致［13］。

由以上可知，淫羊藿苷增強高糖環境下頜骨BMCs的成骨能力。但其具體通路機制還有待于進一步研究。

［1］史曉治，趙詠芳，郭海玲.骨碎補總黃酮與淫羊藿苷對人骨髓基質干細胞增殖及蛋白表達的影響 ［J］.中醫學報，2015（5）∶693-695.

［2］訾慧，李可強，鄭洪新.補腎壯骨滴丸中淫羊藿苷在骨質疏松模型與正常大鼠體內組織分布比較 ［J］.中華中醫藥學刊，2015，33（12）∶2856-2859.

［3］劉童斌，袁月，趙鈺婷，等.載淫羊藿苷緩釋電紡纖維對成骨細胞影響的實驗研究 ［J］.實用口腔醫學雜志，2015，31（6）∶770-775.

［4］石文貴，李雪雁，陳克明，等.基于cAMP-PKA信號通路的淫羊藿苷促進骨形成研究 ［J］.中國現代應用藥學，2015，32（2）∶131-136.

［5］史曉治，趙詠芳，郭海玲.骨碎補總黃酮與淫羊藿苷對人骨髓基質干細胞增殖及蛋白表達的影響 ［J］.中醫學報，2015，30（5）∶693-695.

［6］馬小妮，石文貴，謝艷芳，等.淫羊藿苷對體外培養骨髓基質細胞成骨性分化的影響［J］.解放軍醫藥雜志，2015，27（3）∶16-19.

［7］笪巍偉，趙永見，王擁軍，等.淫羊藿苷對前成骨細胞株OCT1細胞BMP-2 mRNA、Runx-2 mRNA表達的影響［J］.上海中醫藥雜志，2015，49（5）∶90-94.

［8］俞吉，朱裕林，桑冉，等.高效液相色譜法測定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量［J］.實用藥物與臨床，2015，18（6）∶691-693.

［9］傅淑平，楊麗，洪浩，等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓間充質干細胞骨向分化作用的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2015，5（7）∶839-846.

［10］孫闖，楊大威，姜明久，等.不同濃度的淫羊藿苷治療人工關節周圍骨溶解的體外測試［J］.哈爾濱醫科大學學報，2015，49（3）∶214-218.

［11］馬小妮，石文貴，謝艷芳，等.淫羊藿苷對體外在無地塞米松培養基中誘導培養大鼠骨髓基質細胞成骨性分化的影響［J］.安徽醫藥，2015，19（1）∶43-47.

［12］王洪家.雙波長HPLC法同時測定壯骨止痛顆粒中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素含量［J］.天津藥學，2015，27（4）∶17-19.

［13］謝小偉，裴福興，康鵬德，等.鍶鹽聯合淫羊藿苷對大鼠骨髓基質干細胞成骨及成脂分化影響的研究［J］.中國矯形外科雜志，2015，23（5）∶450-458.

Effect of the Content of the Bone Marrow Stromal Cells of Rat Bone Marrow Stromal Cells under High Glucose Condition

LI Chun-mei1，WANG Xin1，ZHOU Li-qun2，KANG Li-xun1，LI Hai-qing1，MA Sheng-li1
1.Department of Stomatology，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China；2.Department of Obstetrics，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China

R285

A

2096-1782（2016）06-0008-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.008

哈爾濱市科技局科技創新人才研究專項基金（2014RFQGJ018）。

李春梅（1981-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，主治醫師，主要從事口腔內科的臨床研究工作。

2016-05-04）