基于倒毛雞LSm14A分子序列分析的原核表達與免疫原性分析

伍昌華，陳紹品，溫貴蘭，李　晨，李天珍，林漢卿，管國丹，王開功，文　明，龔新勇

(貴州大學動物科學學院 預防獸醫學實驗室，貴陽 550025)

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基于倒毛雞LSm14A分子序列分析的原核表達與免疫原性分析

伍昌華，陳紹品，溫貴蘭*，李晨，李天珍，林漢卿，管國丹，王開功，文明，龔新勇

(貴州大學動物科學學院 預防獸醫學實驗室，貴陽 550025)

摘要：旨在探明倒毛雞LSm14A分子序列特征與免疫原性。通過提取倒毛雞肝總RNA，經RT-PCR分別擴增倒毛雞LSm14A全長CDS區與原核表達片段；采用分子生物學技術構建攜帶倒毛雞LSm14分子的原核表達質粒；經IPTG誘導表達、His-tag鎳柱純化表達的重組蛋白質；純化重組蛋白質rHis-cLSm14A分別免疫小鼠與兔制備相應的多克隆抗體；采用間接ELISA與Western blotting方法分析表達蛋白質的免疫原性。結果顯示：倒毛雞LSm14A全長CDS為1 386 bp，與原雞源LSm14A相似性達100%，與鴨源的LSm14A相似性為95.1%；與鼠、爪蟾、猴、人、豬、鵝源的LSm14A相似性相對較低；鼠源、兔源抗cLSm14A多克隆抗體ELISA效價均高于1∶3 200；Western blotting結果顯示，重組表達蛋白質分別被His抗體、鼠源與兔源抗cLSm14A多克隆抗體所識別，蛋白質條帶大小約為19.6 ku。以上結果說明倒毛雞源LSm14A分子具有較高的保守性與良好的免疫原性，研究結果為研究倒毛雞的生物學特性與宿主的抗病毒天然免疫機制奠定了基礎。

關鍵詞：倒毛雞；cLSm14A；免疫原性

Sm(Smith)蛋白家族最早在研究人類前體RNA的加工過程中被發現，參與前體RNA的加工[1]。從原核生物到真核生物的多種生物體內還發現多種含Sm基序的高度保守的同源蛋白質家族，稱之為Sm樣蛋白(Sm-Like，LSm)[2-3]。LSm蛋白是RNA結合蛋白，不同的LSm蛋白在生物中分布廣泛，參與多種RNA代謝過程[4-5]。LSm14A也稱為RAP55A/Tral/Scd6，屬于Sm樣蛋白家族，最先在伊比利亞肋突螈與非洲爪蟾中發現，主要結合在卵母細胞質處理小體上，在進化上具有保守性[6]。近期研究表明LSm14A是一種新型病毒核酸受體，參與宿主細胞的天然免疫反應[7]。倒毛雞是貴州省重點保護與開發的品種之一，但其易患新城疫、傳染性支氣管炎、雞痘等病毒性疾病，發病率為20%～30%，死亡率為70%～80%。為進一步探明倒毛雞的品種特性、有效降低疫病對倒毛雞養殖業的威脅，作者以倒毛雞LSm14A作為研究對象，系統地對倒毛雞LSm14A分子進行了核苷酸與氨基酸序列分析，同時構建了相應的原核表達載體、制備了相應的抗倒毛雞LSm14A的兔源與鼠源多克隆抗體。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物、質粒、菌株10周齡健康倒毛雞5只，由貴州大學動物科學學院歐德淵教授惠贈；體重3 kg左右的健康雄性新西蘭大白兔3只、4～6周的雄性小鼠購自貴州醫科大學實驗動物中心，飼養于本實驗室；pColdⅠ質粒由上海獸醫研究所馬永志教授惠贈；BL21購自碧云天公司。

1.1.2試劑反轉錄試劑購自普洛麥格公司；PCR相關試劑購自寶生物公司；His-tag抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)、超敏ECL化學發光試劑盒等購自碧云天公司；Ni NTA瓊脂糖凝膠購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計參照NCBI GallusLSm14A(基因登錄號：NM_001012778.1)序列，用DNAStar軟件分析LSm14A基因，采用Primer Premier5.0軟件分別設計克隆cLSm14A基因和構建攜帶LSm14A原核表達載體用的特異性引物(表1)。

表1　cLSm14A克隆所需引物

下劃線為酶切位點

The enzyme digestion sites are underlined

1.2.2組織RNA的提取與RT-PCR采用RNA提取試劑盒提取倒毛雞肝總RNA作為模板、Oligo(dT)15為引物、M-MLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA。用反轉錄生成的cDNA為模板、分別采用“1.2.1”的引物擴增倒毛雞LSm14A全長編碼區與原核表達截短區域。

1.2.3cLSm14A序列分析將倒毛雞源cLSm14A核苷酸序列在NCBI網站進行比對分析，采用DNAStar軟件MegAlign方法繪制倒毛雞源cLSm14A進化樹，比較倒毛雞源與其他物種源LSm14A核苷酸序列相似性。利用在線網站(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)對LSm14A蛋白質的二級結構進行分析。1.2.4原核表達質粒的構建分別采用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切PCR產物和pColdⅠ質粒、純化酶切產物、于16 ℃反應條件下連接過夜、連接產物轉入BL21感受態細胞中、菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定，初步鑒定陽性的重組質粒送廣州立菲生物公司測序。測序正確后，陽性質粒命名為pCold Ⅰ-cLSm14A。1.2.5重組蛋白質的誘導表達、純化與鑒定取含有陽性重組質粒pColdⅠ-cLSm14A的BL21表達宿主菌，按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素抗性的LB培養液中、IPTG(終濃度為1.0 mmol·L-1)誘導4 h、8 mol·L-1脲素PBS重懸、超聲破碎處理、Ni NTA瓊脂糖(400 mmol·L-1咪唑洗脫)純化表達蛋白質，蛋白質樣品采用15% SDS-PAGE進行鑒定，純化的重組蛋白質命名為rHis-cLSm14A。

1.2.6抗cLSm14A多克隆抗體的制備將純化的重組蛋白質rHis-cLSm14A與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，分別頸部皮下多點注射新西蘭大白兔(500 μg·只-1)、小鼠(50 μg·只-1)，14 d后改用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白質，依次間隔14 d后，分別進行三、四次免疫。無菌心臟采血、分離血清、分裝保存備用。

1.2.7抗cLSm14A多克隆抗體效價鑒定取“1.2.6”制備的抗cLSm14A兔源、鼠源多克隆抗體分別進行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200倍的稀釋，采用純化的重組蛋白質包被酶標板，按間接ELISA方法分別測定多克隆抗體的ELISA效價。

1.2.8Western blotting檢測蛋白質樣品采用15%SDS-PAGE進行電泳，采用濕轉方法將樣品蛋白質轉移至PVDF膜，0.5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗膜，分別加入His-tag抗體(1∶1 000)、抗cLSm14A兔源多克隆抗體(1∶1 000)、抗cLSm14A鼠源多克隆抗體(1∶500) 4 ℃孵育過夜，洗滌，分別加入HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)、HRP標記山羊抗兔IgG(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h，洗膜，顯色、壓片、曝光、拍照，記錄結果。

2結果

2.1cLSm14A序列分析

RT-PCR擴增結果顯示，倒毛雞源cLSm14A 編碼區約為1 400 bp，測序結果顯示擴增條帶為1 386 bp，與預期長度一致(圖1)。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1、2.cLSm14A基因PCR擴增產物M.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of cLSm14A gene圖1　cLSm14A基因PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1　Amplification of cLSm14A gene

NCBI Blast分析發現，倒毛雞cLSm14A與基因登錄號為NM_001012778的原雞源序列相似度達100%；系統進化樹分析發現，倒毛雞源cLSm14A與鴨源在同一分支，相似度為95.1%；與鼠、爪蟾、猴、人、豬、鵝的LSm14A較遠，相似度分別為61.3%、46.2%、43.2%、43.0%、43.0%、26.7%(圖2)。

通過DNAStar、NCBI網站提供的軟件分析發現cLSm14A含有Sm2與FDF基序；cLSm14A基因編碼的蛋白質中無規卷曲的含量最高(約占整個肽鏈的52.49%)，其次是α-螺旋(占25.81%)，延伸鏈占16.70%，β-轉角占4.99%。

2.2原核表達質粒的構建與鑒定

陽性菌株質粒雙酶切結果顯示，酶切產物約為4 407與474 bp的兩條特異性條帶，與預期大小一致(圖3)。測序結果表明，目的序列正確插入原核表達載體中，重組質粒命名為pColdⅠ-cLSm14A。

圖2　cLSm14A與其他物種LSm14A分子系統進化樹Fig.2　Phylogenetic analysis of LSm14A molecules from chicken and other species

M1.DL2000 DNA相對分子質量標準；1、2.重組質粒pColdⅠ-cLSm14A PCR產物；M2.DL5000 DNA相對分子質量標準；3、4.重組質粒pColdⅠ-cLSm14A EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定M1.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of recombinant plasmid pColdⅠ-cLSm14A；M2.DL5000 DNA marker；3，4.The product digested by EcoRⅠ and XbaⅠ from pColdⅠ-cLSm14A圖3　原核表達質粒pColdⅠ-cLSm14A PCR(A)鑒定與酶切鑒定(B)Fig.3　Identification of the recombinant plasmid pColdⅠ-cLSm14A by PCR (A) and enzyme digestion (B)

2.3重組蛋白質表達、純化與鑒定

15%的SDS-PAGE電泳鑒定結果顯示，重組表達蛋白質rHis-cLSm14A主要以包涵體形式存在，rHis-cLSm14A相對分子質量約為19.6 ku(圖4)，與預期相一致。

2.4抗cLSm14A多克隆抗體的制備

間接ELISA結果顯示，本次制備的抗cLSm14A兔源、鼠源多克隆抗體效價均高于1∶3 200。

2.5Western blotting

Western blotting結果顯示，經IPTG誘導的重組表達蛋白質能與His單抗、兔源多克隆抗體、鼠源多克隆抗體產生特異性反應，條帶均為19.6 ku左右(圖5)。

M.預染的蛋白質相對分子質量標準；1.pColdⅠ-cLSm14A轉入BL21菌經IPTG誘導后超聲菌液；2.pColdⅠ-cLSm14A轉入BL21菌IPTG誘導未超聲菌液；3.pColdⅠ-cLSm14A轉入BL21菌未誘導菌液；4～7.雜蛋白質；8、9.純化的rHis-cLSm14A蛋白M.Protein marker；1.Supernatant of BL21 (pColdI-cLSm14A) induced with IPTG after ultrasound；2.Solution of BL21 (pColdⅠ-cLSm14A) induced with IPTG before ultrasound；3.Solution of BL21 uninduced；4-7.Without rHis-cLSm14A recombinant protein；8，9.Purified rHis-cLSm14A recombinant protein圖4　重組pColdⅠ-cLSm14A蛋白表達產物的鑒定Fig.4　Analysis of expression of recombinant protein pColdⅠ-cLSm14A

A.一抗為His單抗體；B.一抗為鼠源抗cLSm14A多克隆抗體；C.一抗為兔源cLSm14A多克隆抗體；M.預染的蛋白質相對分子質量標準；1.空載體pColdⅠ；2：誘導的pColdⅠ-cLSm14A重組菌A.First antibody is His monoclonal antibody；B.First antibody is ployclonal mouse-anti-cLSm14A antibody；C.First antibody is ployclonal rabbit-anti-cLSm14A antibody；M.Protein marker；1.Empty vector pColdⅠ；2.Purified pColdⅠ-cLSm14A recombinant protein圖5　重組蛋白rHis-cLSm14A的Western blotting鑒定Fig.5　Identification of recombinant protein rHis-cLSm14A by Western blotting

3討論

通過RT-PCR獲得了倒毛雞源cLSm14A全長CDS，大小為1 386 bp；進化樹結果表明cLSm14A分子在本物種中是高度保守的；Western blotting結果顯示cLSm14A具有良好的免疫原性。LSm14A作為新型的核酸受體，可直接識別并結合病毒核酸，有效激活宿主的天然免疫，介導Ⅰ型干擾素的表達，抑制水皰病毒、新城疫病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的復制[8-9]，說明LSm14A蛋白是重要的天然抗病毒免疫分子，本研究為下一步更深層次地探索LSm14A在天然免疫中的作用奠定了基礎。

LSm14A也稱為hRAP55A，不同物種的LSm14A氨基酸比對結果顯示LSm14A的N端高度保守，人源與豬源LSm14A的N端包含一個Sm樣結構域，C端有一個FFD-TFG box結構域，還具有α螺旋形成多個親水的環狀結構FDF結構域[10]；倒毛雞源LSm14A序列分析顯示cLSm14A也含有Sm2與FDF基序，蛋白質二級結構中無規卷曲的含量最高，約占整個肽鏈的52.49%。LSm蛋白家族含有十多個成員，參與各種與RNA代謝有關的信號通路，施一公課題組首次報道了LSm2～8蛋白質復合物自組裝的晶體結構及其特異識別U6小核RNA 3′末端序列的分子機制[11]。倒毛雞cLSm14A的Sm2與FDF基序、蛋白質二級結構在病毒感染中發揮何種作用，還有待于進一步探索研究。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.027

收稿日期：2015-12-28

基金項目：貴州大學博士基金項目[貴大人基合字(2013)12]；國家自然科學基金(31460668)；貴州大學研究生創新基金項目(研農2015024)；貴州大學“本科教學工程”項目(JKSP2013004)；貴州省科技創新人才團隊項目[黔科合人才團隊(2015)4016]

作者簡介：伍昌華(1989-)，男，仡佬族，貴州石阡人，碩士生，主要從事獸醫微生物與免疫學研究，E-mail：1006492290@qq.com *通信作者：溫貴蘭，E-mail：glwen@gzu.edu.cn

中圖分類號：S852.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1511-06

Prokaryotic Expression of theLSm14A Gene in the Frizzle Chicken Based on the Sequence and Immunogenicity Analyses of the Expressed LSm14A

WU Chang-hua，CHEN Shao-pin，WEN Gui-lan*，LI Chen，LI Tian-zhen，LIN Han-qing，GUAN Guo-dan，WANG Kai-gong，WEN Ming，GONG Xin-yong

(PreventiveVeterinaryLaboratory，CollegeofAnimalScienceGuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Abstract:The aim of this study was to explore the sequence and the immunogenicity of LSm14A gene of the Frizzle chicken.Total cellular RNA was isolated from the livers of frizzle chickens hepatic tissue，and full length CDS region and prokaryotic expression fragment of LSm14A gene were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR.The recombinant plasimd was transfected into BL21 competent cells，then His-tag Ni-NTA spin columns were applied to purify the recombinant protein which were produced by IPTG induced BL21.To generate the corresponding hyperimmune serum，rabbits and mice were immunized with the purified recombinant protein rHis-cLSm14A.Sequence analysis revealed that the full length of LSm14A CDS region transcripts from the frizzle chicken was amplified by RT-PCR.The amplified LSm14A CDS region had 1 368 bp and was 100% identical at the base sequence level to the sequence in GenBank.It has a close similarity to the duck source which reaches to 95.1%，on the contrary，the similarity to LSm14A from the mouse source，Xenopus，monkey source，human source，pig source，anser source were distant.The titers of serum mouse-anti-cLSm14A and rabbit-anti-cLSm14A antibodies were both higher than 1∶3 200.Western blotting assay showed that the recombinant protein displayed an immune response with the His-antibody，mouse-anti-cLSm14A hyperimmune serum and rabbit-anti-cLSm14A hyperimmune serum，The band weighted about 19.6 kDa in the western blotting.All the results indicated that the LSm14A molecule of frizzle chicken had a high conservative property and good immunogenicity，which laid a solid foundation for the further study of biological characteristics of frizzle chickens and antiviral natural immune mechanism of poultry.

Key words:the frizzle chicken；cLSm14A；immunogenicity