雛雞免疫器官中chMDA5的表達與定位

欒亞男，葛　銘，李廣興，謝婉秋，楊貴君，張瑞莉

(東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030)

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雛雞免疫器官中chMDA5的表達與定位

欒亞男，葛銘，李廣興，謝婉秋，楊貴君，張瑞莉*

(東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030)

摘要：為研究雞模式識別受體MDA5(chMDA5)在雛雞免疫器官中的表達與定位，分別于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日齡時從50只健康海蘭白蛋雞中隨機選取5只，采取法氏囊、胸腺及脾，應用實時熒光定量PCR、Western blot及間接免疫熒光技術檢測雛雞免疫器官中chMDA5的表達情況。結果發現，在各日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾內均檢測到chMDA5轉錄；在法氏囊淋巴濾泡的皮質、胸腺小葉的皮質和髓質及脾的白髓和紅髓部位均檢測到chMDA5陽性細胞；法氏囊和胸腺組織中chMDA5蛋白的表達規律較為一致，即在1～7日齡呈上升趨勢并在7日齡達到峰值，隨后下調，在14～35日齡時呈波動變化，之后逐漸上調并趨于穩定；脾中chMDA5蛋白表達以14 d左右為一個周期變化，隨著日齡增大其表達量在總體上趨于上調。結果表明，chMDA5在雛雞免疫器官中均有表達，且不同日齡之間的表達存在差異。本研究為進一步探究chMDA5與雛雞免疫功能相關性提供了科學的試驗依據。

關鍵詞：chMDA5；雛雞；免疫器官；表達；定位

先天免疫是動物機體針對病原體入侵的第一道防線，并參與適應性免疫的激活[1]。病原體相關分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMP)會被機體的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別，從而啟動機體的先天免疫應答，如通過分泌Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)等細胞因子抵御病原體的入侵[2]。2005年RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors，RLRs)，即一條不依賴于Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的、能專一性識別細胞質中病毒核酸的新通路被發現[3]。目前已知的RLRs家族成員包括三個：視黃酸誘導基因-Ⅰ(retinoic acia-induced gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)及LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)，它們均位于細胞質中[4]。RIG-Ⅰ識別相對較短的雙鏈RNA(dsRNA)(<1 kb)和5′三磷酸的RNA；MDA5識別較長的dsRNA(>1 kb)[5]；而對LGP2的配體了解較少，目前研究認為它對RLRs信號通路起到調節作用。

MDA5可識別病毒的雙鏈RNA[6-8]。作者實驗室曾對雙鏈RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(infection bursal disease virus，IBDV)感染SPF雛雞外周血液淋巴細胞chMDA5及其信號通路因子表達的動態變化進行研究，結果表明，IBDV能夠激活雛雞體內chMDA5信號通路，并且IBDV復制與chMDA5信號通路因子的表達有著密切關系[9]。MDA5的N端為2個CARD(caspase activation and recruitment domain)結構域串聯而成，稱為效應結構域；中間為DExD/H解旋酶區(DExD/H helicase)，具有水解ATP及結合并解開RNA的能力，稱為調節結構域；C端為RNA結合域(RD，抑制結構域)和與其交疊的C端結構域(CTD)[3]。當MDA5識別其配體后，該信號被傳遞到干擾素-β(IFN-β)啟動子——刺激因子-1(IPS-1)[10]，也稱為MAVS/VISA/Cardif[11-13]，它們通過CARD-CARD結構域相互作用錨定在線粒體膜上。IPS-1通過其C末端一邊募集TRAF2/TRAF6活化IKK激酶復合物，從而激活NF-κB；另一邊募集TRAF3和TBK1使IRF3和IRF7磷酸化，并形成二聚體形式，活化后的這些轉錄因子進入細胞核[14-15]，調控相應的促炎癥因子及Ⅰ型干擾素的表達。產生的IFN-β還可以與細胞表面的特異性受體結合，通過啟動JAK-STAT信號通路引發抗病毒活性并激活適應性免疫[16]。因此，MDA5在識別病原體，激活抗病毒反應中起著重要作用。A.J.Karpala等通過研究提出雞可能缺乏RIG-Ⅰ基因[17]，這就使得MDA5在雞體識別病原體入侵，激活抗病毒天然免疫方面顯得尤為重要。而不同組織器官中MDA5的分布情況可能會影響該部位對入侵病原體的識別。目前，未見有MDA5在雞體器官組織中表達及定位的報道。因此，本研究以在我國飼養較為普遍的海蘭白雛雞為研究對象，依據雞場常規的免疫程序選定研究日齡，采用實時熒光定量PCR、Western blot以及間接免疫熒光方法，研究雛雞在不同日齡時，其免疫器官(法氏囊、胸腺及脾)中chMDA5的轉錄及蛋白質表達水平的變化，為探究MDA5與雞體免疫功能相關性奠定基礎，也為禽類病毒性傳染病的防治研究提供新的方向。

1材料與方法

1.1試驗動物及處理

50只1日齡健康海蘭白蛋雞購自哈爾濱先鋒種雞場，分別于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日齡，隨機抽取5只雛雞進行安樂死，快速采取法氏囊、胸腺及脾，放入液氮速凍后轉入-80 ℃保存備用。

1.2主要試劑及儀器

Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture、RNApure 高純度總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)均購自北京百泰克生物技術有限公司；M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑均購自大連寶生物工程有限公司；高效RIPA組織/細胞裂解液購自北京索萊寶生物技術有限公司；小鼠抗雞MDA5單克隆抗體由本實驗室制備[18]；山羊血清購自博士德生物工程有限公司；抗β-actin小鼠單克隆抗體購自碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；碘化丙啶(PI)購自Sigma公司；ECL超敏發光液購自北京普萊利基因技術有限公司；杭州博日Line Gene 9620熒光定量PCR儀為黑龍江省天力科技開發有限公司產品；冰凍切片機、正置熒光顯微鏡均為德國Leica公司產品。

1.3實時熒光定量PCR法檢測雛雞免疫器官chMDA5 mRNA的表達

1.3.1雛雞免疫器官總RNA的提取及反轉錄按照高純度總RNA提取試劑盒說明書的方法分別提取不同日齡雛雞的法氏囊、胸腺及脾的總RNA，然后根據反轉錄酶說明書進行反轉錄，得到的cDNA -20 ℃保存備用。

1.3.2引物的設計與合成參考GenBank公布的chMDA5基因序列，使用Oligo軟件進行分析設計特異性引物，用于實時熒光定量PCR檢測chMDA5 mRNA的表達情況。同時，參考GenBank公布的chβ-actin基因序列設計特異性引物，作為參考基因，引物由金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1　chMDA5和參考基因目的片段擴增用引物

1.3.3雛雞免疫器官chMDA5 mRNA表達的檢測實時熒光定量反應在Line Gene 9620熒光定量PCR儀上進行，PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火34 s，共40個循環。退火延伸時檢測熒光信號。PCR反應體系：2×Premix 10 μL、上游Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL、下游Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL、cDNA 1 μL、ROX 0.4 μL、PCR水補至20 μL。對PCR結果采用2-ΔΔCt法進行分析，試驗中由PCR儀設定統一的熒光閾值，PCR擴增信號達到閾值后，儀器將計算出此反應所需的循環數為Ct值。以chβ-actin為參考基因，腦組織樣品為對照，各組織相對于腦組織的ΔΔCt值根據以下公式計算：ΔΔCt值=(目的基因Ct值-參考基因Ct值)試驗組-(目的基因Ct值-參考基因Ct值)對照組。利用公式計算出mRNA相對表達量為2-ΔΔCt。

1.4Western blot方法檢測雛雞免疫器官chMDA5蛋白的表達1.4.1雛雞免疫器官總蛋白質的提取將雛雞法氏囊、胸腺及脾組織分別剪成細小的碎塊，加液氮進行研磨，按照每20 mg組織加入200 μL的比例加入裂解液，并按與裂解液1∶100的比例加入PMSF，充分研磨后將樣品12 000 r·min-1離心5 min，取上清，與2×SDS上樣buffer 1∶1混勻，煮沸10 min，得到的蛋白質樣品-40 ℃保存備用。1.4.2雛雞免疫器官chMDA5蛋白表達的檢測選用濃度為8%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE，電泳完畢后，將膠取下，切成適當大小，剪取相同大小的NC膜，分別浸泡在轉印液TTB中20 min，使用半干式轉印儀進行轉印，按從陽極到陰極依次為濾紙、NC膜、凝膠、濾紙的順序重疊起來。設置電壓為15 V，轉印2 h。NC膜用TTBS配制的5%脫脂乳，37 ℃條件下封閉2 h。封閉結束后，TTBS洗膜3次，每次5 min。一抗分別為1∶2 000稀釋的小鼠抗雞MDA5單克隆抗體和1∶1 000稀釋的抗β-actin小鼠單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，反應后TTBS洗膜3次，每次10 min。二抗為1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG，室溫作用1 h，反應后TTBS洗膜3次，每次10 min，TBS洗膜2次，每次5 min。ECL超敏發光液進行化學曝光，利用Image軟件分析Western blot結果。

1.5間接免疫熒光方法檢測雛雞免疫器官chMDA5蛋白的定位

使用冰凍切片機分別將雛雞法氏囊、胸腺及脾制成7 μm的冰凍切片。切片于室溫晾干1 h，置于丙酮中-20 ℃固定20 min，室溫晾干。PBS洗滌3次，每次5 min。正常山羊血清用PBS按1∶100稀釋，室溫封閉20 min。PBS洗滌3次，每次5 min。小鼠抗雞MDA5單克隆抗體按1∶100稀釋，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌3次，每次10 min。異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗小鼠IgG按1∶300稀釋，37 ℃避光孵育1.5 h。PBS洗滌3次，每次10 min。碘化丙啶(PI)復染細胞核，洗滌同前。封片后將切片置于正置熒光顯微鏡下觀察chMDA5蛋白表達情況，陽性反應部位呈特異性綠色熒光。

1.6數據分析

采用Graph PadPrism軟件繪制柱狀圖。

2結果

2.1雛雞免疫器官chMDA5 mRNA轉錄的動態變化

雛雞法氏囊中chMDA5 mRNA的轉錄量在1～14日齡時相近，之后其轉錄量有所下降，28日齡后呈上升趨勢至31日齡達到峰值，之后轉錄量持續下調，直到49日齡時有所上調，如圖1。

圖1　雛雞法氏囊中chMDA5 mRNA轉錄的動態變化Fig.1　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick bursa of Fabricius

雛雞胸腺中chMDA5 mRNA的轉錄量在1～14日齡時相近，之后呈下調趨勢，21日齡后其轉錄量大幅上升，至31日齡達到峰值，隨后又逐漸下調，至45日齡之后趨于穩定，如圖2。

雛雞脾中chMDA5 mRNA的轉錄量在1～21日齡時趨于一致，在28日齡時小幅上調，隨后下調(31日齡)，后又大幅上調，在35日齡時達到峰值，隨后呈持續下調趨勢，至49日齡達到最低值，如圖3。

圖2　雛雞胸腺中chMDA5 mRNA轉錄的動態變化Fig.2　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick thymus

圖3　雛雞脾中chMDA5 mRNA轉錄的動態變化Fig.3　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick spleen

2.2雛雞免疫器官chMDA5蛋白的表達變化

雛雞法氏囊中chMDA5蛋白的表達量在1～7日齡呈上升趨勢，且7日齡時達到所檢測日齡中的最大值，隨后其表達量下降，在14～35日齡之間呈先上升后下降的波動趨勢，之后表達量上調并在42日齡后趨于穩定，如圖4。

圖4　雛雞法氏囊中chMDA5蛋白的表達變化Fig.4　Changes of the chMDA5 protein expression in chick bursa of Fabricius

雛雞胸腺中chMDA5蛋白的表達量在1～7日齡之間呈高表達水平，之后其表達量下降，在14～35日齡之間也呈現出小幅波動趨勢，之后表達量大幅上調并在42日齡后其表達略趨于穩定，如圖5。

雛雞脾中chMDA5蛋白的表達量整體呈現出以14 d左右為一個周期的階段式上調趨勢，在一個周期內又呈現出先上升后下降的變化，并在42日齡后其表達趨于高水平且波動不大，如圖6。

圖5　雛雞胸腺中chMDA5蛋白的表達變化Fig.5　Changes of the chMDA5 protein expression in chick thymus

圖6　雛雞脾中chMDA5蛋白的表達變化Fig.6　Changes of the chMDA5 protein expression in chick spleen

2.3雛雞免疫器官chMDA5蛋白的定位

在雛雞法氏囊、胸腺及脾的細胞質內均可檢測到chMDA5蛋白的表達。其中，法氏囊的免疫陽性反應區域是在淋巴濾泡的皮質和髓質，尤其是皮質部分免疫陽性反應較強且陽性細胞排列緊密(如圖7A)；胸腺小葉的皮質、髓質內均可見較明顯陽性反應細胞(如圖7C)；脾的白髓和紅髓細胞內也可見到特異性綠色熒光(如圖7E)，圖7B、D、F為陰性對照，且均無陽性反應信號。

3討論

RIG-Ⅰ樣受體在動物的絕大多數組織中都有表達，而且它們所介導的先天性免疫反應也在相應的細胞中發生[19]。MDA5是RLRs家族中的重要成員，它能夠識別多種病毒的入侵，從而啟動抗病毒天然免疫反應，誘導Ⅰ型干擾素的產生，是機體抵抗病原體入侵的重要途徑之一[3，20-21]。因此，明確MDA5在機體免疫器官內的分布及表達情況，可為研究MDA5參與動物機體免疫調節及免疫發病機制提供依據。

本試驗從mRNA和蛋白質水平對不同日齡健康雛雞免疫器官法氏囊、胸腺及脾中chMDA5的表達進行研究，結果發現，在各日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾中均檢測到chMDA5的轉錄和蛋白質的表達。法氏囊與胸腺中chMDA5 mRNA表達的動態變化較為一致，均在1～14日齡時相近，隨后開始下調，21日齡后呈上調趨勢并在31日齡時其表達量達到峰值，之后逐漸下調，而法氏囊在49日齡又呈上調趨勢；脾在1～31日齡之間其表達量變化不大，隨后開始上調并在35日齡時達到峰值，之后逐漸下調。脾35日齡時的表達峰值可能是由于中樞免疫器官在31日齡時的高轉錄所致。

mRNA的轉錄變化并不能代表蛋白質水平的表達情況，所以作者又采用Western blot方法對chMDA5蛋白的表達情況進行了研究。結果顯示，法氏囊與胸腺中chMDA5蛋白的表達情況也趨于一致，均在7日齡達到峰值，隨后下調，在14～35日齡時呈波動變化，之后逐漸上調并趨于穩定；脾中其表現出以14 d左右為一個周期的變化趨勢，隨著日齡增大其表達量在總體上趨于逐漸上調。

圖7　雛雞主要免疫器官中chMDA5蛋白的定位(bar=20 μm)Fig.7　Locations of the chMDA5 protein in main immune organs of chick (bar=20 μm)

本試驗從mRNA及蛋白質水平共同揭示chMDA5在雛雞免疫器官中的表達情況，發現在雛雞免疫器官中chMDA5 mRNA與蛋白質表達水平的變化并不完全趨于一致，這可能與體內復雜的轉錄后水平的調控有關。

由于動物機體組織結構與其功能是密切相關的，可從各免疫器官的發育情況來分析chMDA5蛋白的表達變化。曙光等發現蛋雞法氏囊在68日齡時其濾泡的長、寬、皮質及髓質厚度最大[22]，本試驗只檢測到49日齡的雛雞，所以可能未檢測到其最大的表達量。王瑩等發現1日齡雛雞的胸腺組織結構發育已經較完善[23]，作者也的確在1日齡胸腺組織檢測到chMDA5蛋白較高水平的表達。張英楠等發現海蘭白雛雞的脾在7日齡時具備近似成熟的組織結構，但直至35日齡才趨于穩定[24]。作者發現脾在7日齡時chMDA5蛋白呈現出高表達，這一表達情況與其組織結構發育的趨勢基本是相一致的，而作者在42日齡時觀察到chMDA5蛋白的最大表達量，這可能與飼養環境等因素導致其發育情況稍有不同相關。

有研究報道，MDA5主要表達于非免疫細胞中[20]。作者采用間接免疫熒光方法對chMDA5蛋白的表達進行了定位，發現在雛雞法氏囊的淋巴濾泡、胸腺小葉的皮質部和髓質部及脾的紅髓和白髓均有表達，表明chMDA5蛋白在雛雞免疫器官免疫細胞的細胞質中均有表達。

本研究發現，7日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾內chMDA5蛋白表達量均處于較高水平，而在14日齡后均呈現不同程度的下調以及波動狀態，直到42日齡逐漸上調并趨于穩定，這提示我們考慮到chMDA5與其所識別的病毒種類及其易感日齡的相關性，如3～6周齡的雛雞對IBDV最為易感，而最近有研究報道，IBD易感日齡已向兩端延伸[25]，這可能就與chMDA5蛋白的表達在2～6周齡之間均呈較低趨勢相關；已有研究表明雞TLR3也可識別IBDV[26-27]，所以這一猜測還需要與雞TLR3蛋白表達情況相結合而做進一步研究。42日齡以后，免疫器官發育日益成熟，三種免疫器官中MDA5蛋白均趨于高表達且相對穩定在一定水平，應該是雛雞抗病毒能力增強的一個重要因素。另外，7日齡雛雞免疫器官中chMDA5的高表達也提示在生產實際中可在此日齡對雛雞進行相應的免疫，可能會產生更高的抗體水平。綜上，通過研究chMDA5在雛雞免疫器官中的表達與定位情況，對雛雞相應疾病的預防、治療及免疫發病機制的研究均具有指示作用。

4結論

chMDA5在雛雞法氏囊、胸腺及脾中均有轉錄及蛋白質表達，且不同日齡之間的表達存在差異；chMDA5蛋白主要定位于法氏囊、胸腺及脾免疫細胞的細胞質內。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.023

收稿日期：2016-02-01

基金項目：國家自然科學基金(31272533)

作者簡介：欒亞男(1992-)，女，吉林集安人，碩士生，主要從事動物病理學的研究，E-mail：1137072249@qq.com *通信作者：張瑞莉，教授，E-mail：zhangruili@neau.edu.cn

中圖分類號：S852.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1480-08

The Expression and Location of chMDA5 in Chick Immune Organs

LUAN Ya-nan，GE Ming，LI Guang-xing，XIE Wan-qiu，YANG Gui-jun，ZHANG Rui-li*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract:The objective of the present study was to examine the expression and location of chick melanoma differentiation associated gene 5 (chMDA5) in chick immune organs.Fifty health Highland white chicks were euthanized to collect bursa of Fabricius，thymus and spleen at 1，7，14，21，28，31，35，42，45，49-day-old，separately.Then，real-time fluorescence quantitative PCR，Western blot and IFA techniques were used to detect the expression of chMDA5 in chick immune organs.The results showed that the chMDA5 mRNA were examined in bursa of Fabricius，thymus and spleen at each age，chMDA5+ cells were detected in the cortex of bursal lymphoid follicles，the cortex and medulla of thymus lobule，the white pulp and red pulp of spleen.The expression pattern of chMDA5 protein in bursa of Fabricius and thymus tissue was consistent，which showed an upward trend in 1 to 7-day-old chicks and reached peak at 7-day-old，and then went down in 14 to 35-day-old with a fluctuation trend，then gradually increase and stabilized.In spleen，the protein expression of chMDA5 was increased with the increasing age in a period of about 14 days.The results indicated that the chMDA5 were expressed in chick immune organs，and there were differences in expression of chMDA5 with different ages.This study provide a scientific test basis for further exploration about the correlation between chMDA5 and chick immune function.

Key words:chMDA5；chicks；immune organs；expression；location