脫氮硫桿菌的檢測方法及應用研究進展

王詣婧

（福建工程學院生態環境與城市建設學院，福建福州350118）

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脫氮硫桿菌的檢測方法及應用研究進展

王詣婧

（福建工程學院生態環境與城市建設學院，福建福州350118）

摘要：脫氮硫桿菌作為自養反硝化菌的代表菌種，由于其不同于常規廢水脫氮的異養反硝化過程可節省碳源而得到關注。文章介紹脫氮硫桿菌的反硝化功能基因和主要的硫氧化功能基因，分析自養反硝化菌的群落分布特征，對目前脫氮硫桿菌的檢測方法和應用現狀進行綜述，討論目前研究中存在的問題及今后的研究趨勢，以期為進一步研究自養反硝化菌群落結構提供參考。

關鍵詞：脫氮硫桿菌；功能基因；自養反硝化菌；檢測

1904年，Beijerinck首先分離得到脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans），脫氮硫桿菌是以硝酸鹽為電子受體，以各種類型的含硫化合物為電子供體（nitrate-reducing，sulfide-oxidising bacteria，NR-SOB）進行生長的自養型反硝化菌。研究參與這一過程的微生物對于廢水生物脫氮、去除高濃度S2-廢水及減少碳源投加降低反硝化的運行成本均有重要意義。

本文從脫氮硫桿菌這一典型的自養反硝化微生物入手，主要介紹了其氧化硫還原氮的功能基因及其在廢水處理中的研究進程，并和其他NRSOB在環境樣品中的分布進行了比較。以脫氮硫桿菌作為模型菌，收集基礎資料，為自養反硝化微生物進行較為深入全面的研究打下基礎。

1　脫氮硫桿菌的基本生理特性及代謝特征

目前證實的硫桿菌屬有8種，分別為脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）、排硫硫桿菌（Thiobacillus thioparus）、那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus naples）、氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans）、新型硫桿菌（Thiobacillus novellas）、中間硫桿菌（Thiobacillus intermedius）、代謝不全硫桿菌（Thiobacillus perometabolis）。在硫桿菌屬中，只有脫氮硫桿菌具有在缺氧條件下反硝化的能力。脫氮硫桿菌屬于革蘭氏陰性變形菌的β亞綱，短桿狀，長0.5×（1.0～3.0）μm，具有單根極生鞭毛，專性自養，兼性厭氧。可在 10～37℃，pH4.0～9.5的條件下生長，最適生長溫度為28～30℃，最適pH為6.5～7.0。

在硫循環體系中，好氧條件下，脫氮硫桿菌以氧為電子受體氧化硫化合物（如HS-→S0，S0→S2O32-/SO32-/SO42-，S2O32-→ SO42-，SO32-→SO42-），從中獲得能量［1］。缺氧條件下，脫氮硫桿菌以反硝化的方式同時參與硫、氮循環，表1列出了脫氮硫桿菌在缺氧條件下氧化各種形態的硫同時以硝酸鹽作為電子受體獲取能量的反應。

表1　不同硫源的反硝化反應Tab.1 Denitrification reaction of different surphuric sources

2　脫氮硫桿菌的功能基因

目前，脫氮硫桿菌基因測序工作已經完成。脫氮硫桿菌具有完成反硝化全過程的4個關鍵的還原酶（圖1）:硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，Nar）、亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，Nir）、氧化氮還原酶（nitric oxidereductase，Nor）和氧化亞氮還原酶（nitrous oxide reductase，Nos），相應編碼基因分別為 nar、nir、nor、nos。其中，膜結合硝酸鹽還原酶由nar基因簇 narKK2GHJI（Tbd1401-1406）編碼。自然界中存在兩種亞硝酸鹽還原酶，即由nirK編碼的Cu型亞硝酸鹽還原酶和由nirS編碼的細胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶，通常這兩種基因不會同時存在于一個菌株內，而nirS基因相對更廣泛地存在于反硝化細菌菌株中［2］，脫氮硫桿菌即屬于此范疇。編碼一氧化氮還原酶有2個基因簇，RT-qPCR的分析結果顯示norCB（Tbd0562-Tbd0561）的基因表達水平比norCB（Tbd0822-Tbd0823）高50倍之多，因此前者在還原NO過程中具有更重要的作用。低表達基因Tbd0822所合成的酶NorC比高表達基因Tbd0562所合成的酶的碳末端氨基酸殘基多了120個［3］，這可能是造成兩種基因雖具有相同功能基因簇卻有不同表達水平的原因。

圖1　脫氮硫桿菌脫氮脫硫相關功能酶作用機制簡圖Fig.1 Themechanism schematic of the desulfuration and　denitrification　funcitional enzymes　of Thiobacillus denitrificans

一般認為，在好氧條件下，氧氣會抑制反硝化還原酶的活性，相對于其他3個反硝化還原酶（Nar，Nir，Nor），Nos對氧氣最為敏感［4］，因此將N2O還原成N2常成為反硝化全過程的限制步驟。在缺氧狀態下，反硝化還原酶功能基因都呈現上調狀態。Harry R.Beller等人［5］利用反轉錄定量PCR（polymerase chain reaction）證實了脫氮硫桿菌反硝化基因表達水平的相對上調強度順序為nar＞nir＞nor＞nos。有趣的是，脫氮硫桿菌的nos基因在反硝化狀態下上調水平極不明顯，尤其是nosZ基因在好氧和厭氧狀態下均呈現出較高的表達水平，這與在其他反硝化菌株中觀察到的現象不一致［6-7］。

脫氮硫桿菌中與硫化物氧化有關的基因多達50多種，主要有sox基因，dsr基因和依賴AMP將硫化物氧化成硫酸鹽的相關基因（如APS還原酶、ATP硫酸化酶等）。

自然界中硫氧化細菌采用2種途徑氧化硫化物:一種是在多酶復合物參與下，將還原態硫完全催化氧化成硫酸鹽（Sox途徑）；另一種是在氧化過程中，亞硫酸鹽或單質硫作為中間產物，形成顆粒態的硫單質。若硫氧化菌sox基因簇含有sox-CD，則只能利用Sox途徑，不形成單質硫［8］，如與脫氮硫桿菌同樣具有脫氮氧化硫功能的脫氮硫微螺菌（Thiomicrospira denitrifican s）［9］即屬于此類硫氧化菌。對于脫氮硫桿菌而言，其基因簇soxXYZAB不含soxCD，因此可以同時利用兩條途徑進行硫化物氧化（圖1）。soxB是參與催化硫氧化途徑一系列酶的重要組成，它是氧化硫代硫酸鹽的多酶復合物，在反應中心包含一個非朊基的錳簇和一個二價錳的活性位點，催化與半胱氨酸結合的硫代硫酸鹽轉化成硫酸鹽并從結合的蛋白上釋放出來。

3　脫氮硫桿菌的檢測

早期脫氮硫桿菌的檢測方法采用最大可能菌數計數法，劉玲花等人［10］測量硫/石灰石濾柱濾料上脫氮硫桿菌的活菌數為108～109個/mL，異養反硝化菌為脫氮硫桿菌的1/10。但在自然界中可培養的微生物僅占微生物總數的1%，因此該方法具有較大的誤差和局限性。

對16S rRNA基因進行特異擴增后對核苷酸序列進行測定，并與已知菌種16S rRNA進行比較，以此進行的微生物鑒定是目前比較準確的方法之一。趙陽國等人［11］在脫氮硫桿菌16S rRNA基因V3可變區中發現一條27bp的特異序列設計反向引物Thi-d，以16S rRNA基因通用引物BSR8/20為正向引物進行PCR擴增和引物特異性評價，證實該引物的高度專一性。Zhang M等人［12］針對脫氮硫桿菌16s rDNA設計了有高度特異性的引物T-De-F（AAACGGTACGCGCTAACA）和T-De-R（TTGCTTAATAATCCGCCTG）。Nuria Fernandez等人［13］基于 16s rDNA設計了寡核苷酸探針TBD1419（ACTTCTGCCAGATTCCAC）用于檢測脫氮硫桿菌，TBD121（CTCGGTACGTTCCGACGC）用于檢測脫氮硫桿菌和排硫桿菌，TMD131（TCCCAGTCTTTGAGGTAC）用于檢測Thiomicrospira denitrificans。

脫氮硫桿菌sox基因簇與其他硫氧化菌的相似性范圍在28%～55%之間。在sox基因簇中，soxB是唯一可以用來比較α、β和γ變形菌綱之間親緣關系的目的片段［14］。有文獻報道就利用引物對soxB693FK39∶soxB1164B［15］和soxB693F∶soxB1446［16］檢測到脫氮硫桿菌，并繪制出基于硫氧化功能基因構建的進化樹。

4　脫氮硫桿菌在廢水處理中的應用

廢水脫氮的常規方法是生物硝化處理后再進行異養反硝化，在處理過程中常因缺少電子供體而額外投加適量有機物如甲醇維持異養反硝化，而脫氮硫桿菌作為嚴格自養兼性菌可利用硫化物作為電子供體獲取能量，同時還原硝酸鹽為氮氣實現反硝化。

脫氮硫桿菌存在于土壤、泥土、淡水和海洋沉積物、市政污水、工廠污水處理池和消化池中。從厭氧污泥中篩選出的脫氮硫桿菌具有良好的生長繁殖和反硝化能力。底泥富集的菌株相比湖水、土壤也有較好的反硝化效果［17］。值得一提的是，理化因素如pH、溫度、硝酸鹽濃度、攪拌速度等會影響菌體生長和反硝化效果［18-19］。

目前關于硫磺/石灰石自養反硝化系統的研究比較多。Tian C Z等人［20］研究發現，當硫磺和石灰石的體積比為3∶1時，脫氮硫桿菌自養反硝化反應體系達到最佳狀態。硫化物濃度和S2-/ NO3-是影響脫氮除硫效率的關鍵因素，控制硫化物濃度小于300mg/L以及S2-/NO3-比值在5/3～5/2范圍內，可以達到較好的脫硫和反硝化效果［21-22］。劉玲花等人利用 SLAD系統去除地下水中硝酸鹽，出水NO3--N含量為0.03 mg/L，去除率達到98%［10］。Koening利用自養反硝化系統處理NO3--N濃度高達400mg/L的垃圾滲濾液，當水力停留時間為 5.17 h時氮去除率接近100%［23］。脫氮硫桿菌由于自身基因，可以根據調控硫化物與硝酸鹽的比例來決定最終生成硫單質或者硫酸鹽。

需要注意的是，接種脫氮硫桿菌的上流式厭氧污泥床（up-flow anaerobic sludge bed，UASB）反應器長期運行中發現顆粒污泥有解體的趨勢［13，24］，因此需進一步優化運行條件防止污泥上浮，否則將限制脫氮硫桿菌作為工程菌投入實際運行。

5　脫氮硫桿菌反應器自養反硝化菌群落結構分析

觀察人為控制的自養反硝化反應器中群落發展變化也是近年來的研究方向之一。常玉梅等人［25］在對北京污水廠活性污泥強化自養反硝化菌的研究中，以硫磺作為電子供體進行馴化培養，觀察污泥中的群落結構變化，結果發現污泥的增率為0.177 g/（L·d），污泥中細菌類群主要為β-變形菌綱、δ-變形菌綱、γ-變形菌綱和未分類細菌，其中β-變形菌綱類細菌占主導地位。在成熟的反硝化污泥中，Thiobacillus denitrificans所占比例達48.65%。Nuria Fernandez等人［13］將產甲烷顆粒污泥接種到UASB中觀察化能自養反硝化污泥群落結構的動態變化。在成熟的反硝化反應器中確認α、β、γ-變形菌是優勢菌種。脫氮硫桿菌從接種初期占全部染色細胞的1%增長到35%，從初期沒有分離到克隆子增長到占總克隆子數的15%，而Thiomicrospira denitrificans在污泥中僅有很小一部分，占染色細胞的4%。上述研究結果表明，在利于自養反硝化菌生長的條件下，在系統穩定后，脫氮硫桿菌均能成為優勢菌種，但同時其數量僅占細菌總數40%左右，這說明脫氮硫桿菌作為工程菌的效率還有提高的空間。

在以硫源為電子供體的自養反硝化反應器中，Thiobacillus denitrificans和Thiomicrospira denitrificans是最常見的NR-SOB，此外NR-SOB還包括 Arcobacter sp.，Thiohalophilus thiocyanoxidans，Sulfuricurvumkujiense，Thiosphaerapantotropha，Sulfurimonas paralvinellae和Thiomicrospirasp. CVO等。Thiomicrospira sp.CVO既能以CO2為碳源、硫化物為電子供體進行自養生長，也能以有機碳為碳源和電子供體進行異養生長。Thiomicrospira denitrificans和Thiomicrospira sp. CVO同屬于ε變形菌綱，不同之處在于Thiomicrospira denitrificans通過sox途徑將硫化物氧化成硫酸鹽，沒有硫單質的生成，而 Thiomicrospira sp. CVO將硫化物氧化成單質硫和硫酸鹽取決于硫化物和硝酸鹽的比率［26］。Sulfuricurvum kujiense在厭氧條件下反硝化的反應方程是，該菌不能生長在海洋中。Thiohalophilus thiocyanoxidans是從內陸鹽湖中分離出來的第一株嗜鹽的自養反硝化菌，但當硝酸鹽含量高于4～5mmol/L時其生長也會被抑制。在海洋沉積物樣品中檢測到Thiomicrospira denitrificans 和Thiohalophilus thiocyanoxidans為主要的自養反硝化菌群，沒有檢測到脫氮硫桿菌［27］。雖然脫氮硫桿 菌 固 定CO2的 能 力 是Thiomicrospira denitrificans的兩倍，但在特定環境中，仍有未知的因素，如底物的親和性、高鹽度的耐受性，影響兩者的競爭生長。也有文獻指出［28］，脫氮硫桿菌對高鹽度環境的適應性不強，如當SO42-濃度超過250mmol/L時，由于總離子強度的升高，其生長將受到抑制。在UASB反應器中，雖然脫氮硫桿菌與Thiomicrospira denitrificans競爭相同的底物和電子受體，但是前者數量超出后者許多［24］。可能的原因在于Thiomicrospira denitrificans是海洋細菌，在反應器鹽度較低的環境中，由于其碳同化效率僅為脫氮硫桿菌的一半而處于競爭中的弱勢。因此，在一般自養反硝化反應器中，脫氮硫桿菌為優勢菌種，幾乎不存在Thiomicrospira denitrificans，而在海洋沉積物等高鹽濃度的環境中，有Thiomicrospira denitrificans而不能檢測到脫氮硫桿菌。

6　存在的問題

基于16S rRNA繪制的系統進化樹可以比較親緣相近的菌種［29］，但不能鑒定環境中具有某一特定生理特性的一類微生物，因此利用16S rRNA測序的方法研究自養反硝化菌存在困難。反硝化菌不能按傳統的分類學方法被劃分為某些特定種群，即脫氮顯型不能從系統發育進行推斷。如Thiobacillus denitrificans和Thiobacillus thioparus同屬于硫桿菌屬，Thiobacillus thioparus的16S rRNA 與Thiobacillus denitrificans有高達 98%的相似度［30］，二者都能利用無機硫化合物進行化能自養生長，但 Thiobacillus thioparus沒有反硝化功能。與相對保守的16S rRNA相比，功能基因的序列變化豐富，可以利用功能基因鑒定生態功能相同但親緣較遠的微生物種群，如反硝化菌［31］。目前，根據4種反硝化功能基因設計引物調查種群多樣性的工作已展開。以nirS基因為例，Gesche Braker等人［32］根據nirS基因6個相對保守的區域設計的引物對nirS1F-nirS6R已成功應用于多種環境樣品［33］。Throb?ck等人［34］評價了多對nirS基因引物后指出應用cd3aF∶R3cd能鑒定出更多種類的反硝化菌。然而，在各種環境樣品反硝化菌種群多樣性的分析中均沒有看到利用功能基因檢測到脫氮硫桿菌的報道，可能的原因是脫氮硫桿菌的反硝化功能基因同其他反硝化菌的相似性低，一般功能基因的通用引物難以有效地識別脫氮硫桿菌的目的片段。同樣地，鑒定自養反硝化菌群群落結構的瓶頸也在于尋找該類菌種的通用引物。黎乾等人［35］以功能基因nirS為分子標記考察了4次回灌過程中反應器內反硝化微生物群落結構變化，結果表明，4次回灌反應器內的反硝化微生物大部分與β-變形菌綱細菌相似，少數屬于非培養微生物（uncultured bacteria），其中，脫氮硫桿菌和甲基苯反硝化降解菌（Azoarcustolulyticus）是反硝化過程的主要功能微生物。通過標記功能基因反映NR-SOB的多樣性和數量，這對于實際廢水處理的工程應用具有重要意義。這類功能菌基因保守區域相似性比較有待進一步研究，以期開發出能識別脫氮氧化硫這一特殊微生物類群的引物或探針。

7　結語

從部分反應器運行數據看來，脫氮硫桿菌雖然為優勢菌種，但這種桿菌占全部活菌數的比重還有較大的提高空間。對工程應用而言，通過分離出活性更高、脫氮穩定性更好的高效工程菌株，優化反應器參數條件等手段提高反硝化率是下一步工作的重點。對于自養反硝化菌分子生態學分析而言，基于16S rRNA技術定性定量分析自養反硝化菌群落結構和分布特征的工作已經展開。功能基因數據庫的建設是反硝化群落分子生態學研究最基礎的需要，今后的研究可以利用脫氮硫桿菌作為模型菌，進一步研究基于NR-SOB功能基因的自養型反硝化菌的群落結構演替，對豐富自養型反硝化菌群落生態認識有積極的意義，同時也為該功能菌的工程化應用提供科學依據。

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（責任編輯：肖錫湘）

中圖分類號：X703

文獻標志碼：A

文章編號：1672-4348（2016）03-0249-06

doi：10.3969/j.issn.1672-4348.2016.03.009

收稿日期:2016-05-30

作者簡介:王詣婧（1987-），女，福建福州人，助教，碩士，研究方向:廢水處理。

Progress of detection m ethods and applications of Thiobacillus denitrificans

Wang Yijing
（College of Eco-Environmentand Urban Construction，Fuzhou 350118，China）

Abstract:Thibacillusdenitrificans，a representative autotrophic denitrifying bacteria which is different from heterotrophic denitrifiers，has drawn increasing attention.The denitrifying functional genes and key genes putatively associated with sulfur-compound oxidation in T.denitrificans were described.The character of the colony distribution（community structure）of NR-SOBwas analysed. The detectionmeasures and the application state of T.denitrificans in wastewater field were reviewed. Issues to be resolved in the present research were discussed along with the prospects（trend）of the future study.

Keywords:Thiobacillus denitrificans；functional gene；autotrophic denitrifiers；detection