來曲唑構建濕熱型多囊卵巢綜合征大鼠模型及對卵巢StAR蛋白質因子的影響

鄭慧穎，李慶端，蔡雪紅，李麗娜（.漳州市中醫院，福建 漳州 363000；2.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

來曲唑構建濕熱型多囊卵巢綜合征大鼠模型及對卵巢StAR蛋白質因子的影響

鄭慧穎1，2，李慶端1，蔡雪紅1，李麗娜1
（1.漳州市中醫院，福建 漳州 363000；2.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

目的用來曲唑構建多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型，研究其對StAR蛋白質因子的影響。方法將22只6周齡SPF級雌性SD大鼠隨機分為空白組和模型組，空白組大鼠用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組大鼠用1 mg/kg來曲唑加1%羧甲基纖維素灌胃，連續21 d，建立來曲唑誘導的PCOS大鼠模型，造模結束后觀察大鼠體質量、陰道脫落細胞涂片、睪酮、空腹胰島素、卵巢HE染色、StAR免疫組化病理涂片。結果模型組大鼠體質量增加，陰道脫落細胞涂片提示排卵障礙，睪酮升高，空腹胰島素升高，卵巢呈多囊樣改變，卵巢StAR表達活躍。結論來曲唑成功構建了PCOS大鼠模型，StAR表達的活躍度與高雄激素血癥程度呈正相關。

來曲唑；多囊卵巢綜合征；StAR蛋白質因子

多囊卵巢綜合征 （polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以持續性排卵障礙、高雄激素血癥、卵巢多囊樣變和胰島素抵抗為特征的內分泌癥候群，PCOS是一種復雜的內分泌和代謝疾病，發病原因不明，治療較為棘手，是婦科領域的研究熱點和難點。PCOS病因不明，至今無公認的最佳造模方法。因此，尋找一個更符合人類PCOS臨床表現及病理特征的動物模型至關重要。近年來中醫藥治療PCOS受到越來越多的學者認可，尋找具有中醫特色的PCOS動物模型倍受關注。P450芳香化酶抑制劑來曲唑連續灌胃21 d誘導PCOS大鼠模型是Kafali等［1］創立的，來曲唑能阻止雄激素向雌激素轉化，導致高雄激素血癥。本實驗采用來曲唑誘導PCOS大鼠模型，觀察來曲唑是否能構建更符合人類PCOS的動物模型，觀察其對卵巢STAR蛋白質因子的影響。

1材料與方法

1.1動物6周齡SD大鼠22只，SPF級，雌性，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證號：2013001805081。動物飼養及實驗地點設在廈門大學實驗動物中心。

1.2試劑來曲唑（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：15120958）；大鼠胰島素試劑盒（上海閎巨實業有限公司，批號：23029720）；血睪酮試劑盒（雅培貿易（上海）有限公司，批號：10478UP00）；StAR一抗試劑盒（美國Santa Cruz公司，批號：C0615）。

1.3儀器FZ-10002電子天平 （上海凡展衡器有限公司）；DW-40L288超低溫冰箱 （杭州碩聯儀器有限公司）；TDZ4-WS/TDZ4WS臺式低速自動平衡離心機 （湖南湘儀離心機廠）；I2000全自動化學發光儀（美國雅培公司）；7600全自動生化分析儀（日本日立公司）；BX951光學顯微鏡（奧林巴斯公司）；HM525冷凍切片機（德國Microm公司）；電熱保溫箱（上海陽光實驗儀器有限公司）；全封閉自動脫水機（MTM，SLEE）；GHP-9270隔水式電熱恒溫培養箱（上海賀德實驗設備有限公司）；圖像分析軟件（Image J，NIH）。

1.4來曲唑誘導的PCOS大鼠模型構建6周齡SPF級雌性SD大鼠22只，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應性喂養3 d。隨機分為2組：空白組11只，模型組11只。空白組大鼠用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組大鼠用1 mg/kg來曲唑加1%羧甲基纖維素灌胃，連續灌胃21 d。

1.5檢測指標①大鼠體質量。大鼠造模前后各稱重、記錄1次。② 陰道脫落細胞涂片。大鼠自造模第11天開始陰道開口，陰道脫落細胞涂片檢查2個性周期（1個性周期5 d），觀察各組大鼠動情周期變化。③ 血清睪酮、空腹胰島素。大鼠于抽血前1天晚20：00禁食不禁水，次日乙醚麻醉，眼眶靜脈取血2mL送檢，測血清睪酮、空腹胰島素。④ 卵巢形態學。末次灌胃結束，取血完畢，將各組大鼠頸椎脫臼處死，剖腹，摘取雙側卵巢，將大鼠的卵巢組織放入10%富爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，制作HE染色病理片，光鏡下組織學觀察。⑤StAR蛋白檢測。制作StAR蛋白因子的免疫組化病理片，光鏡下觀察，以卵泡膜細胞的細胞膜附近棕黃色顆粒為陽性結果，用Image J軟件分析相應圖片。

2結果

2.1大鼠一般情況造模期間空白組大鼠的一般情況良好，進食狀況好，體態均勻，神態自如，精力旺盛，反應敏捷，不易抓取，被毛光澤貼身，小便清爽，墊料干爽。模型組大鼠在造模開始后1周即出現飲食飲水量增加，形體較臃腫，精神萎靡，懶于活動，反應遲鈍，被毛松散無光澤，尿色黃，墊料粘膩，清洗時墊料偶有結塊現象。

2.22組大鼠造模前后體質量比較見表1。

表1　2組大鼠造模前后體質量比較g

2.3血清睪酮、空腹胰島素見表2。造模后模型組與空白組睪酮及空腹胰島素比較有明顯差異（P＜0.01），說明來曲唑誘導的PCOS大鼠睪酮顯著升高，存在高雄激素血癥。同時說明模型大鼠空腹胰島素也升高，存在胰島素抵抗。

表2　2組大鼠造模后睪酮、空腹胰島素比較

2.4陰道脫落細胞涂片觀察見圖1。

從圖1可見：① 空白組大鼠陰道脫落細胞涂片可見到周期性變化，提示有排卵。圖1-A為排卵前期，以基底層細胞為主，可見散在角化細胞，呈圓形或橢圓形，見深染的核，說明角化不完全，提示大鼠排卵即將開始。圖1-B為排卵期，大鼠動情周期為5 d，與圖1-A相隔5 d后陰道脫落細胞涂片見角化細胞滿布整個視野，基本見不到基底層細胞，角化細胞形狀不規則且見不到細胞核，說明角化完全，提示大鼠已進入排卵期。② 造模大鼠陰道脫落細胞涂片未見到周期性變化，提示無排卵。圖1-C為早卵泡期，基底層細胞滿布整個視野，可見散在的白細胞，見不到角化上皮，提示大鼠尚無優勢卵泡發育。圖1-D為早卵泡期，大鼠動情周期為5 d，與圖1-C相隔5 d后陰道脫落細胞涂片仍未見角化上皮，提示排卵障礙。

2.5卵巢形態觀察見圖2。

圖2-A為空白組：大鼠卵巢體積較小，存在不同發育階段卵泡，可見排卵后的黃體，提示有排卵。圖2-B為造模型組：大鼠卵巢體積較大，呈多囊樣改變，無黃體，提示無排卵。

2.6StAR蛋白因子檢測見圖3。

圖3-A為空白組，卵泡膜細胞層較薄，體積較小呈梭形。圖3-B為模型組，卵泡膜細胞層增厚，體積明顯增大，呈圓球形，且卵泡膜細胞靠近細胞膜附近呈褐色深染（S-P免疫組化法將目的蛋白StAR染為深褐色），提示PCOS大鼠卵泡膜細胞增生、功能亢進，StAR數量增多，功能活躍。

2.7卵巢StAR蛋白相對表達量見表3。

表3　2組卵泡膜細胞StAR表達比較

3討論

3.1來曲唑構建PCOS大鼠模型的理論依據卵泡膜細胞產生的雄激素經過基底膜進入顆粒細胞，在顆粒細胞中FSH誘導P450芳香化酶活性，P450芳香化酶催化卵泡膜細胞轉運來的雄激素生成雌酮，雌酮又在17β-羥甾脫氫酶的作用下轉化為雌二醇。芳香化酶缺乏使雄激素無法轉化為雌激素，血中雄激素水平升高。降低的雌激素對下丘腦和垂體的負反饋減弱，導致 Gn異常升高［2］，卵巢出現PCO樣變。另一方面，來曲唑在卵巢組織內阻斷雄激素向雌激素的轉化，引起卵泡發育微環境中雄激素積聚，雄激素在卵巢局部刺激胰島素樣生長因子等自分泌和/或旁分泌因子等的表達，改變卵泡發育微環境，促卵泡生長［3］。目前常用的芳香化酶抑制劑是來曲唑，文獻報道采用來曲唑造模可使大鼠出現血清睪酮升高，胰島素抵抗，卵巢多囊樣變，大鼠病理生理特征接近人類PCOS特征，是研究該病較為理想的動物模型，且該造模方法與其它注射藥物或皮下埋埴的方法比較，對大鼠創傷性更小，操作更簡便［4-5］。

3.2根據PCOS鹿特丹診斷標準［6］，本實驗來曲唑造模大鼠出現典型的PCOS表現：①體質量增加；② 排卵障礙；③ 血清睪酮升高；④ 空腹胰島素升高，提示存在胰島素抵抗；⑤ 卵巢呈多囊樣改變，說明本實驗用來曲唑成功制作了PCOS大鼠模型，屬濕熱證；⑥ 體質量增加。朱丹溪在《格致余論》中說：“肥人濕多……”。清代章虛谷指出：“體豐者，本多痰濕。”古往今來中醫學家對肥胖的論述甚多，但始終不離痰濕內盛的病機。病機分析：① 精神萎靡，懶于活動，反應遲鈍。濕為陰邪，易阻遏氣機，損傷陽氣，清陽不升，神疲體倦。② 尿色黃，墊料粘膩，清洗時墊料偶有結塊現象。濕性粘滯、重濁、趨下，故見小便粘膩，墊料結塊，尿色黃屬熱。③ 高雄激素血癥。雄屬陽，雌屬陰，雄激素升高則陽氣亢盛，陽盛則熱，可見高雄激素血癥屬熱證。④ 胰島素抵抗。孫剛等［7］檢測了46名非痰濕體質者和35名痰濕體質患者的空腹胰島素、血糖、血脂，計算胰島素抵抗指數，發現非痰濕體質者的上述指標明顯低于痰濕體質患者（P＜0.05或 P＜0.01）。⑤ 卵巢多囊樣改變。夏桂成認為腎陰不足，天癸匱乏，卵子無以充養，發育停滯，痰濕蘊結于卵巢，使卵巢呈多囊樣改變。

3.3StAR蛋白質因子甾體類生成快速調節蛋白（steroidogenetic acute regulatory protein，StAR）。人類的StAR是由285個氨基酸組成的蛋白質，存在于產生甾體激素細胞的線粒體外膜上，它促進膽固醇從線粒體外膜向內膜移動，這個重要過程建立了2層膜之間的聯系位點，允許膽固醇流向低一級的濃度梯度中。在卵泡膜細胞內，膽固醇從線粒體外膜向甾醇相對較少的內膜轉運，是甾體激素產生的關鍵步驟［8］，決定了雄激素產生的速度和數量。本實驗的免疫組化結果顯示來曲唑誘導的PCOS大鼠卵泡膜細胞的細胞膜附近StAR密度明顯升高，表達活躍。大量的StAR將更多膽固醇轉運進卵泡膜細胞線粒體去合成雄激素，從而導致高雄激素血癥。

3.4本實驗發現雄激素合成過程中的關鍵蛋白StAR在來曲唑誘導的PCOS大鼠卵泡膜細胞內高表達，雄激素合成的原料膽固醇被大量轉運入卵泡膜細胞線粒體內去合成雄激素，同時卵泡膜細胞增生、體積明顯變大成圓球狀，提示卵泡膜細胞功能亢進，而卵泡膜細胞是合成雄激素的場所，雄激素在這里被大量合成。說明來曲唑升高雄激素的機理是通過阻礙雄激素向雌激素轉化使雄激素消耗減少，還通過激素間的反饋作用及細胞旁分泌等作用使雄激素合成增加。來曲唑使雌激素生成減少，降低的雌激素對下丘腦和垂體的負反饋減弱，導致LH異常升高。LH受體/cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號通路可誘導雄激素生物合成通路中特定基因的表達，包括StAR基因、膽固醇側鏈裂解酶基因等［9］。綜上所述，來曲唑誘導PCOS大鼠模型，符合人類PCOS西醫診斷標準、臨床表現和病理特征，符合中醫濕熱證表現，來曲唑成功構建了濕熱型PCOS大鼠模型。本實驗StAR升高說明雄激素合成量增加，這一發現為研究PCOS治療藥物降低雄激素的機制提供了一個較新的研究指標。

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R285.5

B

1000-338X（2016）03-0024-03

2016-05-12

漳州市科技局自然科學基金資助課題（ZZ2014J24）

鄭慧穎（1980—），女，主治醫師，2013級中西醫結合婦科內分泌專業博士研究生，主要從事中醫婦科基礎與臨床研究。