TNF-α在丙泊酚誘發的神經元凋亡及認知功能障礙中的作用

鄧小園，陳　博，劉紅亮，戴體俊

(1. 重慶市腫瘤研究所麻醉科，重慶　400030；2. 徐州醫學院麻醉學系，江蘇 徐州　221002)

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TNF-α在丙泊酚誘發的神經元凋亡及認知功能障礙中的作用

鄧小園1，陳博1，劉紅亮1，戴體俊2

(1. 重慶市腫瘤研究所麻醉科，重慶400030；2. 徐州醫學院麻醉學系，江蘇 徐州221002)

目的探討TNF-α在丙泊酚誘發的海馬神經元凋亡及遠期認知功能障礙中的作用。方法7 d齡(P7)SD大鼠隨機分為3組：Control組，無任何處理；P(single)組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1；P(repeated)組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1，每天1次，共7次。丙泊酚兩組于麻醉結束后2 h(對照組則分別對應上述兩時間點)采用Western blot法檢測海馬組織TNF-α含量。另取P7大鼠隨機分為5組：Control組；P(single)組；P(repeated)組；P(single)+ETN組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1前30 min側腦室注射依那西普0.4 mg·kg-1；P(repeated)+ETN組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1，每天1次，共7次，第1次和第4次丙泊酚注射前30 min側腦室注射依那西普0.4 mg·kg-1。于P7、P13、P21、P35時間點，各組采用免疫組化法檢測海馬CA1區神經元凋亡。剩余大鼠于P36-P41行Morris水迷宮實驗。結果丙泊酚單次或多次暴露均使海馬組織TNF-α含量明顯高于同期對照水平(P<0.05，P<0.01)；P(single)組中，活化caspase-3陽性神經元于P7較對照組同時間點明顯增多(P<0.05)，而于其它時間點差異無顯著性(P>0.05)，逃避潛伏期和穿越平臺次數與對照組比較均無差異(P>0.05)；P(repeated)組中，P13、P21、P35時間點活化caspase-3陽性神經元均明顯高于同期對照組水平(P<0.01)，逃避潛伏期從d1～d5均明顯高于對照組同期水平(P<0.01)，且穿越平臺次數明顯低于對照組(P<0.01)； 依那西普側腦室注射后，丙泊酚麻醉后各時點的活化caspase-3陽性神經元、逃避潛伏期及穿越平臺次數與對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。結論TNF-α介導了丙泊酚誘發的發育期海馬神經元凋亡和遠期認知功能障礙，而遠期認知功能障礙可能與持續性神經元凋亡有關。

丙泊酚；TNF-α；神經炎癥；神經元凋亡；認知功能；發育期大腦

靜脈全麻藥丙泊酚目前在嬰幼兒麻醉和鎮靜中廣泛應用，動物實驗表明，丙泊酚在臨床相關濃度內可誘發發育期大腦廣泛神經元凋亡等神經毒性[1]，但相關作用機制仍不知曉。丙泊酚激活中樞GABAA受體產生全麻效應，但目前證實GABAA受體不參與丙泊酚誘發的發育期神經毒性[2]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在神經炎癥反應中釋放最早，且在神經退行性病變的發生發展中發揮重要作用[3]。研究發現，異氟烷及丙泊酚均可導致發育期大腦組織內TNF-α含量明顯增加[4-5]，而且全麻藥多次暴露較單次暴露可誘發更嚴重的神經毒性[6]。但丙泊酚不同暴露次數如何影響TNF-α在腦組織內的含量，以及TNF-α在丙泊酚誘發的發育期神經毒性中發揮何種作用至今尚不清楚。因此本研究應用新生大鼠，觀察丙泊酚不同暴露次數麻醉后海馬組織TNF-α的含量，以及應用TNF-α拮抗劑觀察其對丙泊酚誘發的海馬組織神經元凋亡和遠期認知功能障礙的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物7 d齡(P7)SD大鼠，SPF級，體質量13～18 g，♀♂各半，由重慶醫科大學動物實驗中心提供[許可證：SCXK(渝)2012-0001]。

1.2實驗試劑及抗體丙泊酚(P，批號：MKBK7900V，Sigma公司，美國)；TNF-α拮抗劑依那西普(ETN，批號J36770，輝瑞制藥有限公司，德國)；羊抗TNF-α多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；兔抗羊二抗及羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；兔抗active caspase-3多克隆抗體(Abcam公司，美國)。

1.3實驗分組及麻醉P7大鼠隨機分為3組：Control組(n=12)，無任何處理；P(single)組(n=6)，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1；P(repeated)組(n=6)，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1，每天1次，共7次。丙泊酚兩劑量組于麻醉結束后2 h(分別為P7和P13時間點)，對照組則分別對應上述兩時間點(每時間點n=6)，采用Western blot法檢測海馬組織TNF-α含量。

另取P7大鼠隨機分為5組：Control組；P(single)組；P(repeated)組；P(single)+ETN組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1前30 min側腦室注射依那西普0.4 mg·kg-1；P(repeated)+ETN組，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg-1，每天1次，共7次，第1次和第4次丙泊酚注射前30 min側腦室注射(方法參照Gonzalez-Rodriguez等[7]所描述)依那西普0.4 mg·kg-1。于出生后d 7、13、21、35(P7、P13、P21、P35)時間點(n=6)，各組采用免疫組化法檢測海馬CA1區神經元凋亡[P7時間點只對應Control、P(single)和P(single)+ETN組]。各組中剩余的15只大鼠繼續飼養，并于出生后d 36～41(P36～P41)行Morris水迷宮實驗檢測學習記憶功能。麻醉過程中大鼠置于透明麻醉箱中，箱內通入30%氧氣，流量2 L/min，底部鋪電熱毯，維持直腸溫度(37.0±0.5)℃。1.4Western blot法檢測海馬TNF-α含量大鼠斷頭取腦，分離海馬組織，細胞裂解液裂解組織提取蛋白，BCA法蛋白定量后，每孔上樣量30 μg。經電泳，轉膜，封閉后。加入羊抗TNF-α多克隆抗體(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，兔抗羊二抗(1 ∶1 000)37℃孵育2 h, ECL化學發光法顯影。在Fusion-Fx7凝膠成像圖像分析系統上檢測，顯影結果經Fusion配套軟件進行定量分析。目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值作為TNF-α蛋白的含量。

1.5免疫組織化學法檢測神經元凋亡大鼠吸入4%七氟烷3 min麻醉后，經左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，斷頭取腦。經酒精梯度脫水、石蠟包埋，制成5 μm石蠟切片。參照新生大鼠腦圖譜[8]，每只大鼠選擇與圖譜對應的3張腦組織切片進行染色。石蠟切片經脫臘、水化、抗原修復，H2O2去除內源性過氧化酶活性，正常山羊血清37℃封閉30 min，加入兔抗活化caspase-3多克隆抗體(1 ∶100),4℃孵育過夜；PBS沖洗后，加入羊抗兔IgG二抗37℃孵育30 min；PBS沖洗、DAB顯色、蘇木精復染、酒精分化、飽和碳酸鋰返藍、脫水、透明，中性樹膠封片。活化caspase-3陽性神經元胞質或胞核呈棕黃色，各組每張切片選取3個非重疊海馬CA1區錐體細胞層400×視野，計數各視野每平方毫米面積的活化caspase-3陽性細胞數。3個視野×3張切片的平均值作為每只大鼠的最后結果。

1.6Morris水迷宮測試Morris水迷宮系統(淮北正華生物儀器有限責任公司，中國)為一直徑160 cm、高50 cm圓形水池，池壁上貼有4個不同形狀的白色標記，將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限，將直徑為10 cm的圓形平臺放置于III象限，并使平臺頂低于水面2 cm，池中倒入墨汁以遮蓋平臺，水溫維持在(22.0±0.5)℃。水池上方安裝有攝像機并連接ZH-ZFT型自發活動實驗視頻分析系統，可同步記錄大鼠運動軌跡。Morris水迷宮測試分為兩部分[9]：① 定位航行實驗，實驗d 1～5,大鼠每日分別從4個不同入水點入水，記錄90 s內尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)，若大鼠在90 s內未找到平臺，將其引導至平臺并停留15 s，逃避潛伏期記錄為90 s；② 空間探索實驗，實驗d 6撤除平臺，將大鼠從離原平臺距離最遠的入水點入水，記錄90 s內穿越原平臺次數。

2　結果

2.1丙泊酚不同暴露次數對海馬組織TNF-α含量的影響對照組中P7和P13兩個時間點，海馬組織TNF-α含量無明顯變化(P>0.05)。丙泊酚單次和多次暴露均可使海馬組織TNF-α含量明顯高于同期對照水平(P<0.05，P<0.01)。見Fig 1。

2.2丙泊酚不同暴露次數麻醉后海馬CA1區神經元凋亡的動態變化對照組中，從P7至P35的腦發育過程中，海馬CA1區錐體細胞層活化caspase-3陽性神經元呈遞減趨勢；P(single)組中，活化caspase-3陽性神經元于P7較對照組同時間點明顯增多(P<0.05)，而于P13、P21和P35則與對照組同期水平無差異(P>0.05)。P(repeated)組中，P13、P21、P35時間點活化caspase-3陽性神經元均明顯高于同期對照組水平(P<0.01)。 依那西普側腦室注射后，丙泊酚不同暴露次數麻醉后各時點的活化caspase-3陽性神經元與對照組同期比較差異均無顯著性(P>0.05)。見Fig 2。

2.3丙泊酚不同暴露次數對遠期認知功能的影響P(single)組中逃避潛伏期和穿越平臺次數與對照組比較均無差異(P>0.05)；而P(repeated)組中逃避潛伏期從d 1～d 5均明顯高于對照組同期水平(P<0.01)，且穿越平臺次數明顯低于對照組(P<0.01)；依那西普側腦室注射后，丙泊酚不同暴露次數麻醉后逃避潛伏期及穿越平臺次數與對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。見Tab 1。

Tab 1　Effect of propofol on escape latency and platform crossing ±s, n=15)

**P<0.01vscontrol

Fig 1　Effect of different doses of

A:TNF-α expression from Westem blot;B:Quantification of TNF-α protein levels(ratio to β-actin);#P<0.05vscontrol(P7);**P<0.01vscontrol(P13)

3　討論

大腦在發育期對全麻藥誘發神經毒性的敏感性明顯增加，臨床研究表明，4歲以內的嬰幼兒多次經歷全麻和手術可導致學習能力缺陷的風險增加[10]，而嚙齒類動物在出生后3周內為腦發育高峰[11]，此時期大腦反復暴露于全麻藥可導致廣泛的神經元凋亡和遠期認知功能障礙[4,6]。本實驗結果顯示，丙泊酚單次暴露僅誘發短暫的海馬神經元凋亡，而丙泊酚多次暴露可誘發持續的神經元凋亡及遠期認知功能障礙。研究表明，丙泊酚(75 mg·kg-1)連續7次腹腔注射對呼吸、血糖及血氣無明顯影響[6]，而本研究中使用50 mg·kg-1，連續7次腹腔注射以模擬臨床多次麻醉或長時間鎮靜，亦可排除呼吸、血糖及血氣變化對實驗結果的影響。

Fig 2　Effect of propofol on dynamic changes of densities of active caspase-3 positive neurons

A:Representative photographs of active caspase-3 positive neurons(brown) in hippocampal CA1 region. a：Control group(P7); b：P(single) group(P7); c：P(single)+ETN group(P7); d：Control group(P13); e：P(repeated) group(P13); f：P(repeated)+ETN group(P13);B:Quantification of densities of active caspase-3 positive neurons.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

本實驗中丙泊酚單次或多次暴露均導致海馬組織內TNF-α含量增加，但導致的神經毒性的不同，可能與丙泊酚不同暴露次數引起的TNF-α蛋白在腦組織內增加的持續時間不同有關。研究表明[12]，TNF-α在神經退行性病變中發揮的作用存在作用時間閾值，而丙泊酚多次暴露可能使得海馬組織內TNF-α含量維持較長時間的增高，從而導致持續神經元凋亡增加和遠期認知功能減退。本實驗中，側腦室注射TNF-α拮抗劑依那西普可拮抗丙泊酚誘導的神經毒性，依那西普與釋放至細胞外液中的TNF-α結合并使其喪失生物活性。本實驗結果提示，TNF-α介導了丙泊酚誘發的發育期海馬神經元凋亡和遠期認知功能減退。

生理狀態下膠質細胞釋放少量TNF-α以維持神經元功能和信息傳遞，病理條件下則釋放過多TNF-α以誘發神經炎癥反應。腦內小膠質細胞膜可表達豐富的嘌呤P2X7受體，其在小膠質細胞合成及釋放TNF-α的過程中作用至關重要[13]。丙泊酚可增強三磷酸腺苷誘發的P2X7受體電流或調節P2X7受體的活性[14-16]。因此，本研究中丙泊酚誘發的TNF-α含量增加可能與丙泊酚作用于小膠質細胞膜上的P2X7受體有關。TNF-α主要通過TNF-α受體1相關死亡結構域蛋白，激活外源性途徑而誘發細胞凋亡[17]，這可能是介導丙泊酚誘發的神經元凋亡的機制。但近年來發現丙泊酚誘發的發育期大腦神經元凋亡可通過內源性和外源性兩種途徑[12]，本研究中TNF-α拮抗劑依那西普可完全拮抗丙泊酚誘發的神經元凋亡，因此TNF-α可能亦通過其它機制參與內源性凋亡途徑的激活。研究表明，TNF-α在術后認知功能障礙及阿爾茲海默病的發生發展中均發揮重要作用[3]，而且TNF-α濃度升高可直接導致認知功能障礙的發生[18]。本研究中丙泊酚多次暴露，誘發TNF-α含量增加，并介導遠期認知功能障礙的產生，TNF-α可抑制長時程增強以及神經突起的分化生長[20]，這可能是其導致認知功能障礙的原因之一。

腦正常發育過程中，神經元發生生理性凋亡以適應腦功能和結構的變化。本實驗發現，腦發育過程中，海馬CA1區神經元凋亡程度呈遞減趨勢，而丙泊酚單次暴露只誘發一過性神經元凋亡增加，丙泊酚多次暴露可誘發持續海馬組織神經元凋亡的增加。目前有觀點認為，神經元死亡本身可能不足以導致認知功能障礙的發生[18]。但本實驗結果提示，丙泊酚多次暴露誘發的海馬CA1區持續神經元凋亡的增加，可能與遠期認知功能障礙的發生密切相關。

總之，丙泊酚可導致發育期海馬組織TNF-α含量升高，而TNF-α拮抗劑依那西普可拮抗丙泊酚誘發的海馬CA1區廣泛神經元凋亡和遠期認知功能障礙，丙泊酚單次暴露誘發的神經元凋亡一過性增強不影響遠期認知功能，而丙泊酚多次暴露誘發的神經元凋亡持續性增強可能與遠期認知功能減退的發生有關。

(致謝：感謝重慶醫科大學附屬第一醫院實驗研究中心陳力學、秦光成等老師在實驗中的指導。)

[1]Creeley C, Dikranian K, Dissen G, et al. Propofol-induced apoptosis of neurons and oligodendrocytes in fetal and neonatal rhesus macaque brain[J].BrJAnaesth, 2013, 110(Suppl1): i29-i38.

[2]Peam M L, Hu Y, Niesman I R,et al. Propofol neurotoxicity is mediated by p75 neurotrophin receptor activation[J].Anesthesiology, 2012,116(2): 352-61.

[3]Lyman M, Lloyd D G, Ji X,et al. Neuroinflammation: the role and cosequences[J].NeurosciRes, 2014, 79(2):1-12.

[4]Shen X, Dong Y, Xu Z,et al. Selective anesthesia-induced neuroinflammation in developing mouse brain and cognitive impairment[J].Anesthesiology, 2013, 118(3): 502-15.

[5]Milanovic D, Pesic V, Popic J, et al. Propofol anesthesia induces proapoptotic tumor necrosis factor-α and pro-nerve growth factor signaling and prosurvival Akt and XIAP expression in neonatal rat brain[J].Anesthesiology, 2013, 118(3): 502-15.

[6]Yu D, Jiang Y, Gao J, et al. Repeated exposure to propofol potentiates neuroapoptosis and long-term behavioral deficits in neonatal rats[J].NeurosciLett, 2013, 534: 41-6.

[7]Gonzalez-Rodriguez P J, Li Y, Martinez F, Zhang L. Dexamethasone protects neonatal hypoxic-ischemic brain injury via L-PGDS-dependent PGD2-DP1-pERK signaling pathway[J].PLoSOne, 2014, 9(12):e114470.

[8]Ramachandra R.Atlasoftheneonatalratbrain[M]// Ramachandra R, Subramanian T.BocaRaton, FL:Crc Press, 2011.

[9]Vorhees C V, Williams M T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].NatProtoc, 2006,1(2):848-58.

[10]Flick R P, Katusic S K, Colligan R C, et al. Cognitive and behavioral outcomes after early exposure to anesthesia and surgery[J].Pediatrics, 2011, 128(5):e1053-e1061.

[11]Rice D, Barone S Jr. Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models[J].EnvironHealthPerspect, 2000, 108(Suppl3): 511-33.

[12]Liu Y P, Lin H I, Tzeng S F. Tumor necrosis factor-alpha and interleukin-18 modulate neuronal cell fate in embryonic neural progenitor culture[J].BrainRes, 2005, 1054(2): 152-8.

[13]Chu K, Yin B, Wang J, et al. Inhibiton of P2X7receptro ameliorates transient global cerebral ischemia/reperfusion injury via modulating inflammatory responses in the rat hippocampus[J].JNeuroinflammation, 2012, 9:69.

[14]Nakanishi M, Mori T, Nishikawa K, et al. The effects of general anesthetics on P2X7and P2Y receptors in a rat microgial cell line[J].AnesthAnalg, 2007, 104(5):1136-44.

[15]劉紅亮, 戴體俊. P2X7受體介導丙泊酚對缺氧海馬突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放的抑制作用[J]. 中國藥理學通報, 2010, 26(9):1169-72.

[15]Liu H L, Dai T J. Role of P2X7receptor in the inhibitory effect of propofol on glutamate Ca2+-dependent release from hypoxic hippocampal synaptosomes[J].ChinPharmacolBull, 2010, 26(9):1169-72.

[16]劉紅亮, 戴體俊. 利多可因在異丙酚抑制巨噬細胞膜P2X7受體電流中的雙向調節作用[J]. 中國藥理學通報, 2009, 25(7):911-4.

[16]Liu H L, Dai T J. Impact of lidocaine on the inhibitory effect of propofol on P2X7-gated currents[J].ChinPharmacolBull, 2009, 25(7):911-4.

[17]Harry G J, Lefebvre d′H C, McPherson C A, et al. Tumor necrosis factor p55 and p75 receptors are involvedin chemical-induced apoptosis of dentate granule neurons[J].Neuro-chem, 2008,106(1): 281-98.

[18]Belarbi K, Jopson T, Tweedie D, et al. TNF-alpha protein synthesis inhibitor restores neuronal function and reverses cognitive deficits induced by chronic neuroinflammation[J].JNeuroinflammation, 2012, 9:23.

[19]Mishra A, Kim H J, Shin A H, Thayer S A. Synapse loss induced byinterleukin-1beta requires pre- and post-synaptic mechanisms[J].JNeuroimmunePharmacol,2012,7(3): 571-8.

[20]Stratmann G, May L D, Sall J W,et al. Effect of hypercarbia and isoflurane on brain cell death and neurocognitive dysfunction in 7-day-old rats[J].Anesthesiology, 2009, 110(4): 849-61.

Role of TNF-α in propofol-induced neuronal apoptosis and long-term cognitive impairment in neonatal rats

DENG Xiao-yuan1, CHEN Bo1, LIU Hong-liang1, DAI Ti-jun2

(1.DeptofAnesthesiology,ChongqingCancerInstitute,Chongqing400030,China;2.DeptofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,XuzhouJiangsu221002,China)

AimTo investigate the role of TNF-α in propofol-induced neuronal apoptosis and long-term cognitive impairment in neonatal rats.MethodsSeven-day-old SD rats were randomly divided into 3 groups:Control group(n=12), P(single) group(n=6): propofol 50 mg·kg-1was injected intraperitoneally(ip.)once;P(repeated) group(n=6):propofol 50 mg·kg-1was injected ip. once daily, and for seven times. Hippocampal TNF-α level was measured 2 hours after propofol anesthesia, there were two time points(n=6) in Control group as control levels(postnatal day 7 for P(single) group and postnatal day 13 for P(repeated) group). In another experiment, 7-day-old rats were randomly divided into 5 groups:Control group; P(single) group; P(repeated) group; P(single)+ETN group: ETN(etanercept) 0.4 mg·kg-1was injected intracerebroventricularly 30 min before propofol administration; P(repeated)+ETN group: ETN 0.4 mg·kg-1was injected intracerebroventricularly 30 min before the 1stand 4thadministration of propofol, which was injected ip. for seven times, once daily. Hippocampal neuronal apoptosis was detected at postnatal day 7[P(repeated) and P(repeated)+ETN groups not involved at this time point], 13, 21 and 35, cognitive function was measured at postnatal day 36 to 41 using Morris water maze test.ResultsPropofol with different exposure times could increase hippocampal TNF-α levels(P<0.05,P<0.01); in P(single) group, active caspase-3 positive neurons in hippocampal pyramidal cell layer were much greater than control level only at postnatal day 7(P<0.05), there were no changes of escape latency or platform crossing times compared with control(P>0.05); in P(repeated) group, active caspase-3 positive neurons were more significantly increased at postnatal day13, 21 and 35 than those in control group(P<0.01), escape latency was increased or platform crossing times were decreased more significantly than control in Morris water maze test(P<0.01); after etanercept was administered intracerebroventricularly, there were no significant changes of active caspase-3 positive neurons, escape latency and platform crossing times after propofol anesthesia compared with control(P>0.05).ConclusionTNF-α mediates hippocampal neuronal apoptosis and long-term cognitive impairment induced by propofol in neonatal rats, and long-term cognitive impairment may be related with persistent neuronal apoptosis.

propofol; Tumor necrosis factor-α; neuroinflammation; neuronal apoptosis; cognitive function; developing brain

2016-01-15,

2016-04-22

重慶市自然科學基金資助項目(No cstc2012jjA10005)

鄧小園(1986-)，女，碩士生，研究方向：全麻藥神經毒性，E-mail: 82144950@qq.com；劉紅亮(1975-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，研究方向：麻醉藥中樞神經毒性的作用機制，通訊作者，E-mail: liuhl75@163.com；戴體俊(1943-)，男，教授，碩士生導師，研究方向：麻醉藥理學，E-mail: daitijun@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.012

A

1001-1978(2016)07-0945-05

R-332；R322.81；R329.25；R614.2；R741.022；R971.2

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網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.024.html